Category: наука

Category was added automatically. Read all entries about "наука".

portret

Мутации устойчивости к антителам (часть 1)

Prospective mapping of viral mutations that escape antibodies used to treat COVID-19

Эту статью уже растащили по разным новостным изданиям как полный караул, и вакцина не поможет, и мы опять же все умрем. Это конечно полная ерунда, даже не имеющая ничего общего с тем, что реально было сделано в этой статье. А статья на самом деле очень хорошая и интересная. Но для того чтобы ее объяснить, потребуется довольно обширное введение.

Ин витро эволюция
Начнем издалека. Допустим у вас есть какой-нибудь новый антивирусный препарат и вы хотите понять каким образом вирус может выработать на него устойчивость. Как это можно узнать? Классическим подходом является селекция ин витро. Даем вирусу размножаться в культуре клеток, при этом добавляем этот антивирусный препарат, но в концентрациях, которые не полностью подавляют вирус, а так чтобы он мог продолжать размножаться, пусть и не очень хорошо. Размножаясь, вирус будет мутировать и в конце концов появится мутация, которая делает его устойчивым к этому препарату. Такой мутировавший вирус будет размножаться быстрее дикого и постепенно вытеснит его в культуре клеток. Мы увидим что, во-первых, вирус стал размножаться быстрее (его больше не сдерживает наш препарат), во-вторых, почти все вирусы в культуре несут некую новую мутацию.

Звучит легко и просто, но как это часто бывает, на деле у этого подхода есть множество проблем. Не буду их все перечислять, укажу лишь на некоторые. Во-первых, трудно сбалансировать концентрацию препарата так, чтобы на вирус оказывалось достаточное селекционное давление, но чтобы при этом он мог таки активно размножаться. Если мы добавим слишком мало - у мутировавшего вируса не будет достаточного преимущества над диким для того, чтобы он размножился. Добавим слишком много - вирус плохо размножается, а значит мутации появляются медленно и придется делать это очень долго. Во-вторых, эти эксперименты очень трудоемки - вирус надо постоянно пересеивать на новые клетки, причем в больших объемах, и довольно долго. В-третьих, в вирусах постоянно накапливаются просто случайные мутации и в конце эксперимента бывает что приходится довольно долго копаться чтобы выяснить какая из мутаций действительно дает устойчивость, а какая появилась случайно. Иногда это очень трудно сделать, потому что устойчивость была приобретена через две или даже три разные мутации, каждая из которых по отдельности не имеет эффекта или имеет слабый эффект.

Глубокое сканирование
Группа Джесси Блюма (я знаю пару человек из его лабы) использует интересный подход, который обходит часть из этих проблем. Они пользуются новыми технологиями синтеза ДНК и количественного секвинирования. Сначала они создают библиотеку мутантных вирусов. Они заказывают синтез вирусного гена, но не идеальной его копии, а с мутациями которые по одной меняют каждую из аминокислот на все возможные 19 альтернатив (всего аминокслот - 20). Примерно так: Первые три нуклеотида (аминокислота кодируется тремя нуклеотидами) - случайные во всех возможных комбинациях, а дальше - идеальная копия. Отдельно синтезируется ген в котором вторые три нуклеотида случайные, а остальные - идеальная копия. Затем - третьи три нуклеотида случайные, а остальные - идеальная копия. Все они смешиваются вместе и эти мутированные гены вставляются обратно в вирус и таким образом они одним махом создают всех возможных мутантов, в которых каждая из аминокислот в изучаемом белке мутирована во все остальные девятнадцать. Они это называют "глубоким мутационным сканированием".

Дальше на помощь приходят новые технологии секвинирования, т.е. определения нуклеотидной последовательности генов. Они основаны на том, что секвинируются небольшие фрагменты гена, из которых потом с помощью компьютеров собирается полная последовательность. Но их можно использовать и иначе. Если у вас есть смесь разных, но похожих генов (как в полученной выше библиотеке мутантных вирусов), то компьютеру можно сказать не собрать из полученных фрагментов одну последовательность, а посчитать частоту всех имеющихся в смеси вариантов. Таким образом можно взять полученную библиотеку мутантных вирусов, и получить для каждого мутанта какой процент он составляет в общей смеси. После этого мы можем взять эти вирусы и, например, заразить ими клетки в присутствии нашего препарата, дождаться появления нового поколения вирусов, и опять проанализировать их секвинированием. Если мутант плохо размножается в присутствии препарата - его процент в популяции пойдет вниз. Если хорошо - то вверх. Таким образом мы можем быстро проанализировать огромное число мутаций на устойчивость к данному препарату.

Этот подход конечно же не решает все проблемы, и у него есть серьезные недостатки. Один из основных - если для устойчивости к препарату требуются мутации в более чем одной аминокислоте, то этот метод их не обнаружит.

Все это довольно сложно, если остались вопросы - спрашивайте в комментах. А собственно о результатах статьи напишу чуть позже.
portret

3 месяца спустя

Durability of Responses after SARS-CoV-2 mRNA-1273 Vaccination

Анализ Модерновской вакцины показывает, что антитела сохраняются как минимум в течение 3-х месяцев. Собственно все результаты на одной картинке:



Левый столбец - волонтеры в возрасте 18-55, средний - 56-70, правый - 71 и старше.
Верхняя линия - связывающиеся антитела, остальные три - разные способы измерять нейтрализующие антитела.


Как видно, связывающиеся антитела вообще стабильны, а нейтрализующие немного падают (как и должно быть), но все еще остаются вполне высокими. Такая динамика вообще довольно типична для иммунизации или даже инфекции, по ней нельзя предположить что будет через 6 месяцев, так что предсказывать длительность ответа пока невозможно. Но по крайней мере они не падают сразу же, что тоже иногда бывает, хотя и реже. В целом, это довольно обнадеживающие данные.
portret

Нейтрализующие антитела остаются на многие месяцы

Собственно к чему я собирался написать вчерашнее "короткое введение". Всем уже известно, что антитела на SARS-2 вырабатываются плохо, и даже те что есть - исчезают через несколько месяцев, а то и недель.

Однако вот работа из вполне уважаемой группы и во вполне уважаемом журнале приходящая к совершенно противоположным выводам. Я о ней слышал уже довольно давно, но данные увидел только сейчас.

Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection persist for months

В госпитале Маунт Синай в НЙ еще в марте стали набирать волонтеров переболевших коронавирусом для донирования плазмы, как потенциального лечения тяжелых случаев. У подавляющего большинства симптомы были мягкие или средние, лишь 5% требовали госпитализации, т.е. это вполне репрезентативная выборка по тяжести течения болезни, но скорее всего упускающая очень мягкие или бессимптомные случаи. К началу октября они протестировали 72 тысячи человек и нашли антитела у 30 тысяч.

Для анализа титра антител они использовали не коммерческие тесты, а тест собственного производства, основанный на белке S, который был стабилизирован в той форме, в которой он находится на поверхности вирусной частицы. Соответственно они детектировали не все антитела к SARS-2, а только те, которые распознавали именно этот белок. Это важно, потому что другие работы использовали другие тесты, порою вообще не включающие в себя белок S.

Характеристики их теста - 92.5% чувствительность и 100% специфичность. В двух предыдущих исследованиях (одно из них опубликовано) авторы протестировали людей с положительным ПЦР тестом на коронавирус и показали что их тест на антитела в одном случае нашел их у 99% процентов зараженных, а у в другом - у 95%. Это уже противоречит некоторым исследованиям в которых чуть ли не у половины переболевших не могли найти антител. Но в этом исследовании они пошли дальше.

Вот так выглядит их разбивка по титрам антител:


Тут указаны титры антител (1:80, 1:160 и т.д., чем больше цифра тем больше антител), потом процент людей с таким титром антител, и потом абсолютное их число.


Две трети людей имели "высокие" титры антител (1:960 и 1:2880 и выше). Лишь у 7% титры были низкие (1:80 и 1:160).

Дальше авторы протестировали нейтрализующую активность этих антител в 120 образцах и нашли что как и следовало ожидать - чем выше титр связывающихся антител, тем больше и нейтрализующих антител.


По горизонтали отложены титры связывающихся антител, а по вертикали - титр нейтрализующих антител. Одна точка - один образец. Красные черточки - медианные значения. Пунктирная линия - нижняя граница чувствительности метода, если титр ниже нее, то измерить его не получается и точку ставят на произвольно выбранное значение 5.


Стоит отметить, что нейтрализующие антитела обнаруживались даже у людей с низкими титрами антител, хотя и не у всех (примерно у половины), но если титр связывающихся антител был 1:320 и выше, то такие антитела были практически у всех.

Ну и наконец вопрос о долговечности. Они проанализировали образцы полученные (в среднем) через 50 дней после начального анализа (который был сделан через 30 дней после наступления симптомов и еще через 120 дней. Вот результат:


Долговечность титров нейтрализующих антител. На панели А - у полного набора волонтеров, а на панелях B-F у волонтеров с начальными титрами связывающихся антител, показанными над каждым из графиков. Напоминаю, что чем выше цифра, тем больше антител.


В среднем через 50 дней титр упал процентов на 10, а через 120 дней - примерно в два раза. У людей с более высокими начальными титрами падение было более заметным, раза в 3. Средние титры почти не менялись, а низкие титры сначала немного подрастали (что авторы связывают с тем, что при недостаточном количестве вируса созревание антител занимает больше времени), а потом падали, так что некоторые из них становились недетектируемыми. Но в целом - нейтрализующие антитела были вполне стабильными на промежутке наблюдения в эти 4 месяца (5 месяцев с начала симптомов). Как правило титры антител падают в первые 3-6 месяцев после инфекции, а потом остаются довольно стабильными, так что можно ожидать, что то что авторы видят в конце - это уже надолго.

Возвращаясь к предыдущему посту. Так что - антитела к коронавирусу долговечны или нет? Пока непонятно. Есть работы которые показывают, что антитела вырабатываются плохо и исчезают довольно быстро, а есть работы вроде этой, которая показывает что антитела вырабатываются у всех и остаются как минимум на 4-5 месяцев. Вполне возможно, что оба ответа верны, просто работы эти измеряют разные антитела у разных групп людей.
portret

Про определенность и неопределенность в науке

Если верить тому что жж указал в моем профиле, то через три недели будет 18 лет как я тут пишу. Сначала это было непонятно что, потом дыбр, и только кажется лет через пять после открытия журнала я начал более-менее писать "про науку", ну то есть получается лет 12-13 уже; отнимем недавний перерыв на пару лет и округлим вниз до 10 лет.

Так вот за эти 10 лет самой сложной и непонятной для людей идеей была и остается идея о том, что любой, даже прекрасно спланированный и идеально выполненный, эксперимент сам по себе не дает на выходе некий однозначный факт об окружающем мире. Что если мы хотим узнать вызывает ли А эффект Б, то в одном правильном и хорошем эксперименте А может вызывать эффект Б в очень небольшой мере, в другом правильном и хорошем эксперименте А может давать офигительный эффект Б, а в третьем правильном и хорошем эксперименте А может тоже вызывать эффект Б, но с противоположным от ожидаемого знаком.

"Ну как же так? Кому верить? Кто из них накосячил или просто сжульничал? У кого правильный ответ?" вопрошают читатели и требуют определенности, а я этой определенности им дать не могу потому что у всех правильный. Конечно, бывает что люди и ошибаются и жульничают, но в общей схеме вещей эти ошибки и жульничество не имеют большого долгосрочного эффекта, несмотря на предсказания катастроф от Джона нашего Иоаннидиса и ему подобных. Куда более масштабной проблемой является сама по себе неопределенность результатов.

Мир - очень сложная штука, а любой эксперимент это его упрощенная модель. Экспериментатор в меру своих сил решает какие факторы имеет смысл упрощать, а какие нет, (зачастую у него даже в этом нет большого выбора) и каждый эксперимент - это свой упрощенный мир в котором действуют свои уникальные законы, отличающиеся от реальных законов в окружающем мире. Не бывает экспериментов которые полностью воспроизводят реальный мир - это все равно что рисовать карту мира в масштабе 1:1 - занятие не просто невозможное, но и бессмысленное и бесполезное. Поскольку экспериментаторы действуют на грани известного, то по определению будут факторы которые важны, но о которых экспериментаторы не знают. Поэтому хотя они и делают схожие на первый взгляд эксперименты, но при этом вполне могут получать разные результаты, даже если эксперименты поставлены правильно.

Для любого, кто занимался наукой, эта неопределенность - неотделимая часть жизни. Среда, в которой он варится постоянно, и ничего удивительного в этом не видит. Когда еще люди печатали статьи на бумаге, у всех были папки со статьями на темы над которыми они работали и в этих папках лежали статьи с этими самыми "А вызывает Б" и "А не вызывает Б" и все возможные вариации (сейчас наверно папки электронные или коллекции в Zotero). Что еще важнее - все эти вариации держатся не только в папках, но и в головах постоянно.

Лишь очень постепенно вся эта каша противоречивых результатов устаканивается, важные факторы определяются, эксперименты начинают давать схожие результаты, и знание кристаллизуется в то, что потом пишут в учебниках. Но к этому времени наука уже уходит вперед и занимается новыми проблемами, которые все еще являются неопределенными.

Это я хотел небольшое введение к посту написать, но что-то растекся мыслью по древу. Так что сам пост теперь будет уже наверно только завтра или вообще когда руки дойдут.
portret

Репликация коронавирусов

Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2
Как всегда у Nature Reviews - отличный обзор по базовым фактам о жизненном цикле "усредненного" коронавируса.

Утащу оттуда первую картинку и переведу основные моменты.



Желтым цветом на картинке помечены шаги репликации вируса, а красным - возможности эту репликацию как-нибудь остановить. Я буду приводить исходные названия на английском, чтобы было понятно о какой части картинки идет речь.

Жизненный цикл коронавируса во многом похож на жизненный цикл многих других РНК вирусов имеющих липидную оболочку.

Receptor binding. Начинается все со свободно плавающей вирусной частицы, которая содержит в себе 4 основных вирусных белка - шип оболочки S, белок оболочки E, матрикс M, и нуклеокапсид NC, внутри которого находится вирусный геном в виде одноцепочечной РНК. Эта частица с помощью шипа оболочки S должна связаться с рецептором ACE2 на поверхности клетки-мишени. На этой стадии вирус можно нейтрализовать заблокировав это связывание, что обычно делают нейтрализующие антитела, но можно разработать и другие подходы.

Entry. Помимо связывания с белком ACE2, шип S также должен быть разрезан в определенном месте какой-нибудь хозяйской протеазой, например TMPRSS2. Связывание шипа S с ACE2 и это разрезание ведут к изменениям в белке S, который меняет форму и физически сближает вирусную липидную оболочку и оболочку клетки, что ведет к их слиянию. Это слияние может происходить как на поверхности клетки, так и внутри эндосом - специальных "пузырьков" которыми клетка захватывает наружное содержимое или просто рециркулирует клеточную мембрану и поверхностные белки. Так или иначе, содержимое вирусной частицы оказывается внутри клетки. На этой стадии можно заблокировать вирус блокируя клеточные протеазы, но это довольно сложно, потому что у них есть важные функции и вообще их в организме очень много.

Fusion and uncoating. Самое главное содержимое вирусной частицы - вирусный РНК геном. Внутри вирусной частицы он заключен внутрь капсулы (капсида), состоящей из белка NC. Когда этот капсид оказывается в цитоплазме клетки-мишени, то он распадается высвобождая вирусную РНК, которая для клетки-мишени выглядит как любая другая РНК произведенная ею самой в ядре.

Primary translation and polyprotein processing. Клеточная мРНК используется как матрица для синтеза клеточных белков (трансляции). Хозяйские системы берут вирусную РНК и начинают производить по ней (вирусные) белки. Эти 16 белков производятся не каждый отдельно, а как два больших "поли-белка". Внутри одного из этих поли-белков имеется вирусная протеаза, она активируется и нарезает эти поли-белки на их составляющие. Если эту протеазу ингибировать, то это должно остановить репликацию вируса.

Viral RNA synthesis and Translation. Заметьте, что на этой стадии вирус состоит в одной-единственной молекуле РНК. Для дальнейшего размножения вирусу надо наработать множество копий своего генома. Получившиеся в результате трансляции и нарезания вирусные белки "отбирают" исходную копию РНК у хозяйских механизмов трансляции и начинают копировать ее. С +РНК цепи делаются копии -РНК, которые служат матрицей для создания новых +РНК, с которых опять делаются копии -РНК и т.д. Этот процесс идет в эндоплазматическом ретикулуме - специальном клеточном органе, находящемся около ядра и состоящем из массы липидных слоев. Обычно он служит клетке для синтеза белка, но вирусные белки приспосабливают его для того, чтобы наделать сложные двойные пузыри и прочие структуры в которых идет синтез вирусного генома.

Процесс репликации вирусного генома - один из основных шагов для блокирования вирусной репликации, потому что обычно клетка не делает копии РНК с другой РНК, и для этого у вируса существует белок, которого обычно нет в клетке - РНК-зависимая-РНК-полимераза. Этот шаг атакует например гилеадовский ремдесевир.

Accessory proteins-host interactions. Помимо основного генома, вирус также создает укороченные геномы, которые служат для синтеза целого ряда вирусных белков. В ходе этого процесса создаются новые РНК, кодирующие новые белки, которые на начальной стадии вирус производить не может. Эти белки могут иметь самые разные вспомогательные функции, например блокировку сигналов опасности, которые обычно запускает зараженная клетка.

Assembly. Но основная цель вируса на этой стадии - наработать как можно больше белков для создания новых вирусных частиц, все тех же S,E,M,NC. Они собираются вместе, распознают вирусную РНК, и создают новую вирусную частицу. На этой стадии обычно происходит ряд разных процессов которые в принципе можно постараться заблокировать.

Exocytosis. Вирусная частица собирается около клеточной мембраны. В клетках существуют механизмы позволяющие "выпятить" и "отщипнуть" часть клетки внутрь специальных секреторных пузырьков внутри клетки, в результате чего получаются "пузырьки внутри пузырьков", вот их вирус и использует для своих целей. Новые вирусы оказываются внутри секреторных пузырьков унося с собой часть клеточной мембраны, которая на этой стадии становится вирусной мембраной.

Virus release. Секреторные пузырьки опустошаются наружу, выпуская новое поколение вирусных частиц, которые могут заражать новые клетки.
portret

Коктейли моноклональных антител

Напишу коротенький ликбез о том, что это за чудо такое, которым даже вот полечили Трампа, хотя FDA пока не выдала даже экстренное разрешение на использование.

Выработка антител
Все слышали, что в ответ на инфекцию вырабатываются антитела, но не все наверно знают, откуда эти антитела в организме берутся. В нашем геноме нет гена ни одного антитела, но в нем есть набор кусочков генетического кода из которого можно ген антитела собрать. Когда одна из клеток становится B лимфоцитом, то в ней специальные ферменты нарезают эти кусочки, бОльшую часть случайным образом выкидывают, и собирают из оставшихся ген антитела. Поскольку кусочков для каждой части антитела очень много, то существует очень много вариантов собрать из них ген антитела. В дополнение к этому в ген антитела встраиваются также случайные кусочки, что еще больше увеличивает разнообразие возможных вариантов, и поэтому в каждом B лимфоците ген антитела получается уникальным. Заметьте, что таким образом геном каждого B лимфоцита в вашем организме отличается от вашего "основного" генома.

Поскольку процесс сборки гена антитела из фрагментов во многом случайный, то как минимум в 2/3 новых лимфоцитов получается не ген антитела, а какая-нибудь ерунда. Иммунная система проверяет все новые B лимфоциты, иногда дает им еще один шанс собрать антитело, и если антитело так и не собралось, то они умирают. Во многих случаях в результате сборки получаются антитела, которые связываются с собственными белками хозяина - такие B лимфоциты тоже умирают. B лимфоциты с успешно собранным антителом какое-то время живут (недели-месяцы), но если они не находят мишени с которой их антитело связывается, то и они тоже умирают, чтобы дать место новым B лимфоцитам с новыми генами антител. Этот процесс идет в нашем организме постоянно с самого рождения и всю жизнь.

Поликлональные антитела
Если же антитело нашло мишень (например связалось с белком S) на поверхности вируса, то происходят две вещи. Во-первых такой лимфоцит активируется и начинает активно делиться. Во-вторых, в его потомстве идет направленный мутагенез - специальные ферменты намеренно мутируют именно ген антитела (даже так - именно определенные части этого гена), чтобы произвести множество новых близкородственных вариантов этого антитела. Эти варианты конкурируют между собой и лимфоциты, чьи антитела связываются с вирусом сильнее - выживают и размножаются, а те лимфоциты, чьи антитела хуже связываются с вирусом - умирают.

Если лимфоциту повезло и ему достался очень хороший вариант антитела (который очень хорошо связывается с вирусным белком), то он активно размножается. Все его потомство происходит от одной начальной клетки и генетически идентично. Это и называется "клоном". Таких клонов в ответ на каждую инфекцию появляется множество и каждый производит свое антитело. Поэтому когда мы берем сыворотку крови, то она содержит антитела от большого множества клонов - это "поликлональные антитела". У поликлональных антител есть свои преимущества - они содержат множество самых разных антител, каждое из которых атакует немного иную часть вируса и имеет уникальные свойства. Но есть и недостатки. Во-первых, поликлональные антитела приходится получать от переболевших волонтеров и поэтому их невозможно наработать в промышленных масштабах. Во-вторых, иммунная система не умеет отличать нейтрализующие антитела от не-нейтрализующих, она смотрит лишь на связывание, поэтому среди всех этих антител возможно есть нейтрализующие антитела, но скорее всего они составляют лишь небольшую часть от всех антител и этого может не хватать для нейтрализации вируса. Поэтому хорошо бы иметь возможность выделять антитело от индивидуального лимфоцита.

Моноклональные антитела
Раньше получение моноклонального антитела это была очень сложная технология, требующая кучи работы и массу времени. Однако сравнительно недавно (лет 10-15 назад), появились технологии позволяющие сделать это намного быстрее (разница на порядки). Есть разные методы и технологии постоянно совершенствуются, я расскажу лишь об одной из них.

Берут образец крови у человека переболевшего некой болезнью, в данном случае коронавирусом. Очищают лимфоциты и потом добавляют к ним помеченный белок против которого хотят найти антитела, например белок S от коронавируса. Если B лимфоцит производит антитело, которое связывается с белком S, то он через это антитело "поймает" помеченный белок и таким образом этот лимфоцит сам окажется помечен. Все лимфоциты проходят через машину, которая "смотрит" на каждую клетку и если она "помечена", то машина складывает ее в отдельную ячейку на плашке, а если нет, то выбрасывает. Таким образом из одного образца можно получить сотни или даже тысячи B лимфоцитов с антителами к белку S. Работают с этими клетками не вручную, а используя роботов. Ко всем этим лимфоцитам робот добавляет специальные реагенты, которые стимулируют их деление и таким образом из одной клетки в ячейке образуется несколько десятков или сотен клеток, которые производят одно и то же антитело. Произведенного ими антитела достаточно чтобы протестировать, может ли это антитело нейтрализовать вирус (это тоже все делается роботами и данные считываются автоматически). По результатам этого тестирования можно определить, какие из лимфоцитов производят нейтрализующие антитела к вирусу.

После этого можно выделить ДНК из клеток из соответствующих ячеек, и с помощью ПЦР наработать достаточно ДНК именно гена соответствующего антитела. Этот ген потом можно заклонировать, наработать, изучить и (если результаты подтвердятся) ввести в специальные продуцирующие клетки - и вот вы имеете в довольно больших количествах моноклональное антитело, т.е. антитело произведенное одним клоном B лимфоцитов.

Эффективность моноклональных антител
Первым и долгое время единственным лекарством на основе моноклональных антител было антитело против вируса RSV, его вводили недоношенным новорожденным для предотвращения инфекции этим вирусом. Сейчас моноклональные антитела - одна из самых горячих областей новых разработок в медицине. Для чего их только не пытаются использовать, и для рака, и для астмы, и для ВИЧ.

При использовании моноклональных антител против вирусов возникает несколько проблем. Во-первых, многие вирусы умеют хорошо избегать антитела и появляются устойчивые к антителам мутанты. Поэтому приходится использовать несколько антител сразу (так называемые "коктейли" из 2-4 антител), чтобы уменьшить вероятность устойчивости. Во-вторых, антитела нейтрализующие вирус в культуре не всегда работают в организме. Например, когда несколько лет назад была эпидемия Эболы, то в одном испытании тестировали четыре разных коктейля антител, из которых только один сработал хорошо (от компании Regeneron), два ЕМНИП не сработали вообще, а один работал, но не очень хорошо. В-третьих, антитела приходится вводить на очень ранней стадии инфекции, когда вируса еще довольно много, но когда еще непонятно кто заболеет серьезно, а кто нет. И введение их - процедура непростая, это обычно капельница которая в течение нескольких часов вливает вам 100-300 мл антитела. Для Эболы это было оправдано, потому что серьезно заболевает большинство зараженных.

На крыльях успеха после разработки коктейля против Эболы, Regeneron сразу же взялся разрабатывать коктейль антител против коронавируса. Рассмотрев несколько альтернатив, они выбрали два антитела. Сравнительно небольшое (меньше 300 человек) клиническое испытание закончилось буквально на днях и на мой взгляд показало довольно средненькие результаты. Среди волонтеров с довольно мягким протеканием болезни (без госпитализации), они сократили время до исчезновения симптомов с 13 дней до 8 дней (только среди тех волонтеров у которых было мало своих антител к вирусу) и раза в два уменьшили количество вируса. Что несколько странно - большая доза антител сработала хуже чем меньшая доза. Т.е. какая-то польза есть, но это точно не панацея. На основании этих результатов пока FDA даже не спешит выдавать разрешения для использования, и на мой взгляд это верно. В целом мне кажется для коронавируса лечение моноклональными антителами не имеет большого смысла. Как я выше писал - их следует давать очень рано, как только были обнаружены симптомы (или даже раньше), но на этой стадии непонятно, будет ли человек среди 80% которые переносят инфекцию легко, или среди 20% которые требуют госпитализации. Многочасовое вливание антител - это сомнительное удовольствие, на которое вряд ли много кто пойдет.

Но вот Трампу влили, даже без авторизации FDA. В принципе это имело смысл, потому что его протестировали и обнаружили вирус еще даже до наступления симптомов, т.е. как раз на самой ранней стадии, когда эти антитела еще имеют шанс сработать. Но по одному человеку конечно невозможно будет судить о том, был ли от них какой-либо эффект.
portret

Опять про вакцину от Гамалеи

На прошлой неделе в очень престижном журнале Lancet вышла статья с результатами испытаний первой и второй стадии вакцины от института Гамалеи. Я был занят, поэтому ни прочитать ни написать что-либо не успел, только сейчас руки дошли. За это время prof_afv разобрал данные как по безопасности, так и по иммунному ответу:
Статья о ГамКовидВак в Lancet. Часть 1 - иммуногенность
Статья о ГамКовидВак в Lancet. Часть 2 – безопасность
Я с его выводами совершенно согласен, так что если хотите узнать что я думаю - читайте там.

Добавлю лишь пару моментов:
1. У довольно большого процента людей существуют антитела к вирусу Ad5, что по идее должно снижать эффективность этого вируса как вектора для вакцины. Результаты от китайской вакцины основанной на этом векторе показали что такой эффект действительно имеется. Поэтому довольно удивительно, что авторы не обнаружили эффекта таких антител на своей вакцине. Это не то чтобы невозможно, но хотелось бы увидеть графики с титрами, а не просто коэффициенты корреляции в таблице.
2. prof_afv на мой взгляд слишком мягко критикует то, что эти испытания названы испытаниями смежных 1/2 стадий. То, что они называют испытанием первой стадии (введение Ad5 и Ad26 компонент по отдельности), таковым на самом деле не является. Испытание первой стадии должно тестировать именно конечный продукт (то есть комбинацию Ad5 и Ad26), а не отдельные его части. Соответственно когда они тестируют свой конечный продукт на 20 волонтерах, это и есть испытание первой стадии, а никакой не второй. Это очень грубая манипуляция и я несколько удивлен, что статью пропустили в таком виде. Хотя возможно рецензенты тут ничего уже сделать не могли, потому что определение стадий испытаний - это ответственность регуляторных органов в стране, где они проходят.

Еще сегодня в новостях открытое письмо от группы ученых из Италии, в котором они указывают на странные совпадения в результатах иммунного ответа между разными группами внутри этого испытания. Я не знаю, что о нем думать. Конечно, некоторые странные совпадения там действительно имеются, но мне они не кажутся уж прямо явными фальсификациями, вполне могут быть и совпадениями. Но главное - то что авторы внесли в свой список совпадений титры антител на 21 и 28 день (красные и желтые коробочки на рисунке 2), наводит на мысли, что они очень вольно интерпретируют "совпадения" - на мой взгляд нет ничего удивительного в том, что титры антител сильно не изменились за неделю. Но вообще по "совпадениям" я не специалист, надо спрашивать людей анализировавших например результаты выборов или голосований на математические аберрации. И вообще я не вижу зачем ученым из Гамалеи было бы нужно рисовать эти титры - я не сомневаюсь, что если вставить ген белка S в аденовирус и ввести это человеку, то иммунный ответ будет, рисовать ничего не надо.
portret

Немного про защитный иммунитет

В предпоследнем выпуске TWIV, Шейн Кротти подтвердил то, о чем я где-то у себя в журнале уже писал (возможно в комментах): Утверждения о быстрой потере иммунитета к SARS-2 изрядно преувеличены.

После инфекций или вакцинаций уровень антител всегда после пика падает, причем как минимум с двумя разными периодами полураспада. После того как организм справился с инфекцией, большинство клеток производящих антитела довольно быстро умирают, и производство новых антител прекращается. Первый период - это исчезновение антител наработанных во время инфекции, период полураспада тут обычно одна-две недели и занимает оно от двух до четырех месяцев. Поэтому в первые несколько месяцев уровень антител всегда падает примерно на порядок. После этого все определяется тем, как ведут себя оставшиеся в живых плазма клетки (долгоживущие клетки производящие антитела). У них полураспад гораздо дольше, от многих месяцев до десятков лет, и чем он определяется точно никто не знает, но факт тот, что он занимает гораздо дольше, поэтому уровень антител наблюдаемый через 6 месяцев после инфекции обычно остается довольно стабильным. Я пока видел только статьи о первой стадии падения, но не о собственно долговечности антител во второй стадии. Это падение на начальной стадии - вполне нормально и не является какой-то особенностью именно коронавирусной инфекции.

Хотя динамика уровня антител после инфекций или вакцинаций примерно одинакова, разные инфекции и вакцины достигают разных пиковых уровней количества антител, соответственно если пиковый уровень был очень высоким, то после падения и выхода на стабильную фазу он будет все еще довольно высоким и скорее всего защитным. А если начальный уровень был низким, то после падения он может стать недетектируемым. Уровень антител после SARS-2 инфекции очень сильно варьирует и коррелирует с тяжестью болезни, кто сильнее болел, у того и титр антител будет выше (как правило). Очень мало (или вообще нет) случаев, когда антитела после инфекции не детектируются совсем. Соответственно, у людей что переболели легко - уровень антител с самого начала не очень высок, и после первого падения становится совсем низким или даже недетктируемым.

Падение уровня антител конечно беспокоит, но не надо забывать что это лишь одна часть иммунной системы. Помимо нее остаются клетки памяти (B, CD8 T, CD4 T) и они вполне могут иметь защитные свойства, если не против инфекции, то против болезни.

Шейн также сказал, что все разговоры о том, что иммунитет к сезонным коронавирусам недолговечен основаны всего на одном исследовании из Англии (ссылку к сожалению не дали, а самому искать некогда), в котором людей намеренно заражали сезонным коронавирусом, а потом через 8 месяцев заражали опять и все тестируемые заразились. Но он указал на то, что в результате повторной инфекции никто из тестируемых не заболел, т.е. иммунитет не защищал от заражения, но защищал от болезни. Если кто-то найдет статью, то хотелось бы еще увидеть, пытались ли авторы повторно заразить людей не через 8 месяцев, а скажем через месяц после первой инфекции - возможно используемая ими доза была такой высокой, что даже пиковый иммунитет не мог с ней справиться.

По поводу повторных заражений, немного обсуждали в прошлом посте. И еще в иммунитетную копилку - вчерашний пост от prof_afv.

Upd: Нагуглил вот такой вот интересный препринт: Coronavirus protective immunity is short-lasting. На первый взгляд, несмотря на пессимистичное название, там все выглядит не так уж плохо. Самые ранние реинфекции там наблюдались через 6 месяцев (редко), самый частый срок реинфекции был 12 месяцев, а медианный срок 2-4 года. Странно, что статья будучи на стадии препринта еще в июне до сих пор нигде не была опубликована, возможно в ней какие-то серьезные проблемы, надо внимательно прочитать.
portret

Как коронавирус борется с иммунной системой

Где-то в комментах дали ссылку на вот эту довольно интересную статью:
Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2

По меркам РНК вирусов, геномы коронавирусов довольно большие - 30К нуклеотидов, что позволяет им кодировать довольно большое количество белков. Один из этих белков NSP1 значительно варьирует по последовательности и по размерам, но имеет одинаковое свойство, а именно - блокирует в зараженных клетках трансляцию.

Вкратце напомню: наши гены закодированы в ДНК, которая находится в ядре, с ДНК снимаются копии РНК, РНК идет в цитоплазм, где рибосомы транслируют РНК и по ним синтезируют белки, которые собственно и отвечают за практически все строение и функции клеток.

Зачем коронавирусам блокировать трансляцию, ведь клетка от такого блока довольно быстро умрет? Точно не известно, но одна из теорий заключается в следующем. В клетках существуют сенсорные механизмы, которые по разным признакам детектируют появление в ней вируса, и в ответ запускают производство интерферона. Интерферон это сигнальная молекула и он действует как на саму зараженную клетку, так и на все другие клетки поблизости и запускает огромное количество самых разных антивирусных механизмов. Однако большинство этих механизмов не активируются моментально а требуют экспрессии генов, кодирующих соответствующие белки. Я точно не помню, но что-то вроде 10 процентов всех наших генов это гены, которые активируются в ответ на интерферон и производят белки отвечающие за антивирусные системы. Отсюда ответ очевиден - нет трансляции, нет и антивирусных белков, и коронавирус может делать в клетке что хочет.

ОК, теперь собственно к статье. На самом деле самое интересное я уже рассказал, в статье уже собственно детали, в которые я вдаваться не буду, покажу лишь самую интересную картинку из нее.

Авторы добавляют Nsp1 к части рибосомы с которой он связывается (это показано в предыдущих экспериментах, которые я пропустил) и используют криоэлектронную микрофотографию чтобы определить структуру получающегося комплекса. Это довольно крутой метод, разработанный в последние лет 10, который позволяет собирая информацию с тысяч фотографий (с довольно низким разрешением) получать детали молекулярной структуры с разрешением до атома. И вот что они видят:



Про Nsp1 известно, что он состоит из большой глобулярной части от которой тянется гибкий "хвостик" с небольшой "кисточкой" на хвосте, состоящей из двух спиралей. И вот на этой структуре видно что у канал рибосомы, в который обычно заходит РНК, физически "заткнут" этой "кисточкой" белка Nsp1, что не дает туда войти РНК и таким образом блокирует трансляцию. Остальную часть Nsp1 разглядеть не удается, видимо потому что гибкий "хвост" дает возможность основной части белка болтаться как попало (т.е. она не находится в какой-то конкретной позиции, которую можно было бы определить) но вот эта кисточка там сидит очень уверенно и авторы потом даже определяют какие конкретные ее аминокислоты взаимодействуют с аминокислотами в канале.

Некоторые (особо умные) читатели уже наверно сообразили что у этого вирусного механизма борьбы с иммунным ответом есть одна большая проблема - вирусу для репликации и производства новых вирусных частиц тоже нужны белки, а значит и трансляция. Но у вируса похоже все "продумано" - каким то образом его собственная РНК обходит этот блок, видимо что-то вынимает хвост Nsp1 из рибосомы, и позволяет синтез вирусных белков. Но вот каким - никто пока не знает.
portret

Вакцина от Модерны - первые результаты

Вышла небольшая статья по результатам испытания первой стадии вакцины от компании Модерна.
An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 — Preliminary Report

Сначала вкратце о самой вакцине
Вакцина нацелена на уже обсуждавшийся неоднократно белок оболочки S (см. предыдущие записи). При формировании вирусной частицы этот белок встраивается в липидную оболочку и разрезается на две части, которые однако остаются соединены вместе. Разрезаный белок подобен взведенной пружине, в нем заключается энергия необходимая для сливания вирусной мембраны с мембраной клетки которую вирус заражает. После того как этот белок связывается с рецептором на поверхности клетки, одна его часть отваливается, а вторая меняет свою форму так чтобы слить две мембраны. Поэтому этот белок по своей природе нестабилен, но исследователи научились делать мутации, которые стабилизируют этот белок и не дают ему разваливаться. Именно такой белок используется в вакцине от Модерны, для того чтобы вырабатываемые против него антитела узнавали белок S в той форме в которой он находится на поверхности вирусной частицы.

В наших клетках все белки кодируются в ДНК, которая находится в ядре, с ДНК снимается копия РНК, которая идет в цитоплазм клетки и там используется для синтеза белка. Модерновская вакцина - это РНК кодирующая описанный выше белок S. После введения ее в мышцу, РНК попадает в цитоплазм окружающих клеток и эти клетки какое-то время производят белок S. Этот белок оказывается на поверхности клеток, но не покидает их, потому что в клетках нет остальных белков необходимых для создания вирусной частицы. На этот белок вырабатывается иммунный ответ. РНК долго в клетках не живет, постепенно разрушается. Кроме того, иммунный ответ видит клетки с такой РНК как зараженные вирусом и убивает их. Поэтому через некоторое время вакцина в организме разрушается, а на белок остается иммунный ответ.

Дизайн испытания
Испытание было не слепое, т.е. все знали кто получает какую дозу вакцины. В нем также не использовали плацебо, все волонтеры получали вакцину. Учитывая что технология вакцины основанной на РНК - очень новая, испытание было проведено с очень постепенным увеличением дозы. Волонтеров разбили на три группы, одна получала дозу в 25 микрограмм, другая в 100, и третья в 250. В каждой группе было по 15 человек. Начинали испытание с самой низкой дозы и даже ее давали не всем сразу - сначала небольшой группе, если все в порядке - то еще одной небольшой группе, если все в порядке - то остальным, если все в порядке - то небольшой группе с более высокой дозой, и т.д.

Каждому волонтеру давали две дозы - одну в первый день, и вторую - через 4 недели (29 день).

Волонтеры были в возрасте 18-55 лет. Модерна уже набрала и более пожилых волонтеров (у них иммунный ответ обычно хуже), но результатов по ним еще нет.

Результаты по безопасности
Из 45 человек 42 получили обе дозы. У одного волонтера через 5 дней после первой дозы на ногах появилась сыпь, непонятно было связана ли она с вакцинацией, но вторую дозу решили не давать. Два волонтера просто не смогли вовремя придти на второй визит из-за карантина связанного с тем, что у них было подозрение на КОВИД-19, а результаты (отрицательные) не были еще известны.

Серьезных побочных эффектов не наблюдалось, были стандартные для вакцин, в основном боль или раздражение в месте инъекции. После второй дозы побочных эффектов было существенно больше, но опять же - ничего серьезного. Это в целом согласуется с опытом тестирования РНК и ДНК вакцин на животных и людях - они как правило вполне безобидны и не вызывают серьезных реакций.

Результаты по иммунному ответу - антитела

Все основные результаты приведены вот на этой картинке:



Разберем панель А подробнее, чтобы понять на что следует обращать внимание. Здесь приведены титры антител связывающихся с белком использованным в вакцине. Каждая точка - волонтер, чем выше она находится, тем больше у волонтера связывающихся с белком S антител. Внизу написаны дозы полученные волонтерами, а также дни в которые измерялись титры.

Рассмотрим группу получившую 25 микрограмм вакцины. В первый день, когда им дают первую дозу, у них еще нет антител к белку S, как и следует ожидать. Через 2 недели после инъекции (день 15) мы видим титры 10^3-10^4. Это не очень много и опять же согласуется с опытом РНК и ДНК вакцин - они вызывают не очень сильный иммунный ответ. На 29 день им дают вторую дозу вакцины, титры антител в этот день сравнимы с тем, что были две недели до этого. Через две недели после второй дозы (день 36), титры поднялись примерно в 10 раз, примерно до 10^5. Это очень даже неплохо, но не сногсшибательно - некоторые вакцины дают титры и в 10^6 и в 10^7. Спустя 4 недели после второй дозы титры остались примерно на таком же уровне, может немного пошли вниз, что нормально - титры антител всегда немного падают после начального пика.

Группы с 100 мкг и 250 мкг можете рассмотреть сами. Основной вывод там для меня - титры существенно выше после первой дозы, но примерно такие же после второй, т.е. более высокая доза возможно даст более быструю защиту, но в долгосрочном плане скорее всего большой разницы не будет. Важно конечно посмотреть на то, как долго эти титры продержатся и Модерна собирается из измерять через 3, 6 и 12 месяцев после второй дозы. Возможно что более высокие дозы дадут более долговечный ответ. Пока этих данных нет.

Заметьте, что самый последний столбец справа на панели А - это титры антител у переболевших коронавирусом. К сожалению не указано как эти люди были отобраны, как у них протекала болезнь, и через какой срок после выздоровления были взяты эти образцы. Но в целом мы видим, что вакцина дала сравнимые или даже более высокие титры чем естественная инфекция. С одной стороны это очень хорошо, с другой стороны появившиеся уже исследования антител у переболевших говорят о том, что титры антител у них не очень высокие, так что это довольно низкая планка.

На панели B приведены титры антител для связывания не с целым белком S, а с самой важной его частью, узнающей рецептор на поверхности клетки-мишени. В целом они близки к титрам на панели A, так что ничего особо интересного я тут добавить не могу.

На панели C несколько другие данные. Это не связывание антител с белком, а способность этих антител нейтрализовать вирус. В данном случае - не сам коронавирус, а лентивирус (может даже ВИЧ, я не вникал в детали) несущий на своей поверхности коронавирусный белок S. Как я уже ранее где-то писал, такие вирусы гораздо безопасней живых вирусов, поэтому их часто используют для подобных экспериментов. Подобно результатам со связывающими антителами, результаты по нейтрализации опять же выглядят неплохо с их титрами в районе 128-512, но не сногсшибательными. Опять же - они чуть выше чем у переболевших, что обнадеживает, но планка не велика.

На панели D - нейтрализация собственно коронавируса. Те же комментарии, что и по панели C.

Результаты: Клеточный иммунитет
Недавно вышло несколько статей указывающих на то, что клеточный иммунный ответ может играть важную роль в контроле коронавируса при естественной инфекции. Что у этой вакцины с клеточным ответом? Практически ничего. Они видят ответ с CD4 Т клетками, которые важны для выработки антител, что вполне согласуется с результатами выше (без CD4 Т клеток вряд ли бы они получили такие титры антител), но не видят CD8 Т клеточного ответа (CD8 лимфоциты узнают и убивают зараженные клетки). Это не удивительно - предыдущий опыт с РНК и ДНК вакцинами предсказывал такой результат, они всегда дают довольно слабый CD8 ответ.

Выводы
В целом эта статья подтвердила мои ожидания от Модерновской вакцины. Вполне нормальная безопасность. Неплохие, но не сногсшибательные титры антител, как связывающихся, так и нейтрализующих вирус. Почти никакого клеточного ответа. Достаточно ли этого будет для защиты или хотя бы для смягчения болезни - неизвестно и предсказывать не берусь, но имеются все основания провести испытание на эффективность. Вполне возможно, что этого будет достаточно.

Отдельный важный вопрос о том, насколько долго продержатся эти антитела. Сейчас много шума про падающие титры при естественной инфекции. Мне это несколько странно, потому что иммунологам очень хорошо известно что после выздоровления титры антител падают раз в 10 всегда (иногда и в 100 раз), это так практически со всеми инфекциями (и вакцинами). После этого изначального падения они обычно остаются на полученном уровне довольно долго. Важно чтобы этот стабильный уровень был достаточно высок, чтобы давать защиту, а мы пока не знаем каков этот необходимый для защиты уровень. Так что паниковать несколько рановато, нужны данные.