portret

Стабильность вируса

Статья: Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1


Коротенькая статья, авторы которой протестировали стабильность вируса в разных условиях, причем сравнили SARS (синий) и новый CoV-SARS-2 (красный). Upd: Тестирование проводилось при 20 градусах Цельсия и 40% влажности. На панели A - исходные данные, на панели B - регрессия, позволяющая посчитать период полураспада, на панели С - посчитанный период полураспада (т.е. время за которое количество живого вируса уменьшается в два раза).

Слева - вирус распыленный в аэрозоль. Полураспад - примерно 1 час, т.е. каждые 3.5 часа количество вируса уменьшается в 10 раз.
Вторая панель - размазанный на медь, на нем тоже около часа. Зачем на медь я не понял, где сейчас человек встречает чистую медь в обычной жизни?
Третья панель - картон. Интересно, что картон новый вирус переносит куда лучше первого SARS и на полураспад уходит аж 4 часа. Мойте руки после открытия посылок от Амазона и вообще открывая почту :(
Четвертая панель - нержавеющая сталь, 6 часов. Тоже довольно долго.
Пятая панель - пластик. Лучше всего для вируса, аж целых 7 часов.

Чего в этой статье нет, так это связи с реальным миром. Как используемые в этом исследовании дозы связаны с реальными дозами вируса, которые можно образуются когда человек кашляет или растирает сопли по дверной ручке? Также неизвестно как эти дозы сочетаются с вероятностью заражения - сколько нужно вируса в аэрозоле, чтобы вдохнув его была существенная вероятность заразиться?

Тем не менее, по результатам этой статьи стоит очень внимательно относиться к тому, что мы трогаем и чем мы дышим. Предметы остаются заразными часами, если не сутками. С воздухом все труднее - после кашля основной вирус будет в довольно крупных каплях, которые должны быстро оседать, но часть будет и в аэрозоле и эта часть остается живой часами.
portret

Белок S (продолжение)


Закончим разбор предыдущей статьи. Мы остановились на том, что авторы получили псеводтипированный вирус VSV который нес на себе белок S из нового коронавируса, который они называют SARS-2. Этот вирус уже можно использовать для изучения свойств SARS-2.

Для того, чтобы попасть внутрь клетки, вирусу как правило нужно связаться с каким-нибудь белком на ее поверхности. Про SARS было известно, что он связывается с белком ACE2. Поскольку S белок SARS-2 очень похож на S белок SARS, то логично было предположить, что и он тоже использует ACE2.

Для того, чтобы это проверить, авторы первым делом попробовали заразить полученным вирусом целый набор клеточных линий, полученных от людей и от разных животных, что и показано на панели С. В верхней части картинки - заражение диким вирусом VSV, у которого белок оболочки довольно необычен тем, что позволяет вирусу заражать огромное количество самых разных клеток. Интересно, что несмотря на очень широкое использование этого свойства, до сих пор точно не определено, с чем же именно он связывается на поврехности клеток. Так или иначе, верхняя панель - это просто контроль на то, что все эти клеточные линии в принципе могут быть заражены.

На средней панели заражение псевдотипированным VSV несущим белок S от SARS. Видно, что он хорошо заражает парочку человеческих клеточных линий, другие чуть похуже или вообще нет, отлично клетки обезьян и хорошо собачьи. Остальные почти не заражает.

На нижней панели результаты с белком S от SARS-2. Видно, что результаты почти идентичные средней панели, что намекает на то, что этот вирус связывается с тем же белком на поверхности клеток, что и SARS (т.е. ACE2).


Для подтверждения этого предположения, делаем "контрольный выстрел" - панель А на картинке справа. Берем клетки BHK-21, которые (как видно из эксперимента выше) SARS-2 не заражает. Добавляем у них на поверхности человеческий белок ACE2 - теперь заражает; ACE2 из летучих мышей - тоже заражает; человеческий APN (рецептор для вируса MERS) - не заражает (но MERS заражает); человеческий DPP4 (рецептор для еще одного коронавируса) - не заражает.

На этом, казалось бы, можно остановиться, но авторы делают еще пару экспериментов, которые подчеркивают чем действительно хорошая работа отличается от средненькой. На панели В они делают дополнительный контроль - берут обезьяньи клетки Vero (которые как мы видим выше заражаются SARS и SARS-2) и перед инфекцией они добавляют к ним антитела против ACE2. Эти антитела связываются с этим ACE2 и не дают связаться с ним белку S, таким образом блокируя инфекцию вируса. И действительно - эти антитела блокируют как SARS, так и SARS-2, но не MERS. Таким образом они показывают, что инфекция этих клеток проходит именно через белок ACE2, а не какой-либо еще белок на их поверхности.

И самый последний контроль на панели С. Чтобы подтвердить, что результаты предыдущих экспериментов - не артефакт наблюдаемый лишь с псевдотипированным VSV вирусом, авторы повторили таки эксперимент с диким SARS-2, выделенным из пациента и показали что добавление ACE2 к клеткам BHK-21 ведет к активному распространению SARS-2 в этих клетках.
portret

Белок S

Предыдущий выпуск закончился выкладыванием геномной последовательности нового коронавируса в публичные базы данных. А продолжаем мы с того, как эта последовательность может быть использована.

Статья: SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor



Разберем буквально половину первой картинки. Заранее прошу прощения у биологов, буду разбирать все буквально на пальцах, чтобы всем было более-менее понятно.

Эта статья фокусируется на белке S. Белок S - это наружный белок вируса, который собственно и является той "короной" которую мы видели в предыдущем выпуске на электронной фотографии. Этот белок используется вирусом чтобы прицепиться к клетке-мишени и затем слить мембранные оболочки вируса и клетки, таким образом доставляя содержимое вирусной частицы в клетку.

Выложенную последовательность нового коронавируса (авторы называют его SARS-2) можно сравнить с другими коронавирусами. Лучше всего с SARS, потому что (как было написано в прошлом выпуске) это самый близкородственный к нему человеческий вирус. Просто даже по этой информации уже можно сделать кое-какие (теоретические) выводы.

Смотрим на панель А. Во-первых, это довольно стандартный короновирусный белок S. У него есть две основные части - S1 отвечает за связывание с клеткой, S2 - за собственно проникновение внутрь. В S1 есть район который собственно и связывается с белком на поверхности клетки мишени. В S2, почти на С-конце есть район TD которым S крепится на мембране вируса. Во многих коронавирусах (но не в SARS) между S1 и S2 есть место которое режется протеазой, так что эти две части превращаются в два отдельных белка, которые тем не менее остаются соединенными вместе, не распадаются. Судя по последовательности авторы предположили, что скорее всего в SARS-2 именно так и происходит.

ОК, переходим от теории к практике. Как можно делать с этим белком эксперименты если у тебя нет ни белка, ни даже гена который можно было бы использовать чтобы этот белок произвести? Буквально лет 15 назад воспроизведение в своей лаборатории нужного гена с известной последовательностью было бы нетривиальной задачей. Пришлось бы начать с близкородственного гена (например SARS) и потом путем множественных шагов с клонированием и мутагенезом постепенно воспроизводить нужный. Сейчас же существует куча коммерческих компаний, которым можно просто послать по емейлу требуемую последовательность и через считанные дни получить нужный кусок ДНК по почте. Это не просто быстрее, но зачастую даже и дешевле, особенно если проект сложный. Это и сделали авторы. Они просто синтезировали кусок ДНК кодирующий белок S нового SARS-2.

При работе с белками очень удобно иметь антитела, которыми связываются с нужным белком и позволяют "увидеть" и отличить его от всех прочих белков. Для S белка нового коронавируса (который авторы этой статьи называют SARS-2), таких антител еще не было, поэтому авторы приделали к хвосту этого белка специальную метку (HA) для которой такие антитела существуют. Поскольку они все равно синтезировали ДНК, то им это сделать было довольно просто - заказывая ДНК они просто добавили в конце соответствующую последовательность.

На верхней части панели B мы видим примерно то, что предсказывалось по последовательности - белок вируса SARS не разрезан и имеет вес примерно 180kDa, а белок вируса SARS-2 есть и целиком и в порезанном виде (90kDa). Это просто белок полученный в клетках, а на вирусе эти белки иногда ведут себя несколько иначе. Как это проверить?

Есть такой супер-удобный для данных целей вирус VSV. Он хорош тем, что неприхотлив - когда он выходит из клетки то цепляет на себя любой белок который есть на поверхности клетки, и если этот белок может осуществлять связывание и слияние мембран, то ему этого достаточно. Собственный белок оболочки VSV при этом можно выкинуть, чтобы он не мешался в экспериментах. Дополнительным плюсом является то, что вирус этот совершенно безопасный, поэтому с ним можно работать без особых предосторожностей, которые были бы нужны для работы с диким вирусом SARS. Такая система называется псевдотипирование вирусов.

Авторы псевдотипировали VSV белками S от SARS и от SARS-2 и результаты мы видим на панели B внизу. У SARS белок так и остался целым, а у SARS-2 он практически весь порезан на S1 и S2 фрагменты. S2 мы видим на картинке, потому что именно к нему прикреплена метка HA которую распознают антитела, а S1 не виден. Там есть еще дополнительная тонкая полоска в районе 130kDa - что это такое я не знаю и авторы не упоминают, я думаю это скорее всего продукт какой-то деградации белка, возможно в нем есть еще какой-то сайт по которому его режет какая-то протеаза.

На этом пока все, к панели C вернемся в следующем выпуске.
portret

Новый коронавирус из пациентов с пневмонией в Китае

Начинать надо конечно вот с этой статьи:
A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019

В ней описаны совершенно классические вирусологические подходы (с поправкой на развитие технологий), которые использовались для изначального выделения и характеризации этого вируса.

Началось все с того, что в клиники стали приходить люди с острой пневмонией. Им сделали бронхео-лаважи, довольно неприятные процедуры, когда через трубку в легкие вводится физраствор (или что-то похожее), и потом отсасывается обратно в надежде, что в нем будет то, что собственно и вызвало пневмонию. Жидкость протестировали на 18 известных вирусных и 4 бактериальных инфекции, безрезультатно.

Тогда из образца выделили всю присутствующую там РНК, перевели ее в ДНК, и отсеквинировав без разбора получили последовательности всего что там плавало. Полученные последовательности автоматически сравнивались со всеми известными вирусами и микробами в публично-доступных базах данных. По результатам подавляющее большинство полученных последовательностей совпали с последовательностями коронавирусов, более того - на 85% совпавших даже с конкретным вирусом ранее выделенным из летучих мышей. До появления современных методов секвинирования на подобный проект ушли бы годы, а сейчас это возможно за несколько дней.

Пользуясь этой информацией они протестировали эти образцы уже более направленно, используя праймеры нацеленные на эволюционно-консервативный кусок коронавирусов и получили положительный результат, хотя праймеры и не очень хорошо сработали (что было вполне ожидаемо).

Затем они выделили вирус. Для этого использовались культуры клеток полученных от людей проходящих операции по удалению рака легких. Полученные из них клетки сейчас умеют выращивать в специальных условиях на границе жидкости и воздуха, так что они формируют этакий искуственный легочный эпителий, который можно еще и размножать. Лаважную жидкость отфильтровали от особо крупной грязи и добавили к культурам клеток. Время от времени их слегка обмывали физ-раствором сверху (со стороны воздуха) и переносили собранную жидкость (после фильтрации) на еще незараженную культуру - стандартный способ показать инфекционную природу явления.

Через какое-то время в культуре накопилось столько вируса, что даже под световым микроскопом стали заметны его патогенные эффекты, в том числе и пропадание биения ресничек на эпителиальных клетках. На картинке это плохо видно, но в реальности должно быть куда заметней. Как оказалось такие сложные эпителиальные культуры делать было не обязательно: похожие результаты с некоторой задержкой они получили и на обычных клеточных линиях, полученных как от человека так и от обезьян.

На этой стадии образцы также отправили на электронную микрофотографию. Результаты ниже.



Слева вирус крупным планом. По краям у него видны "протуберанцы" которые и дали название этому семейству вирусов (по сходству с солнечной короной). Размер вирусных частиц довольно разнообразен - от 60 до 140 нм, т.е. примерно с вирион ВИЧ. Справа зараженная эпителиальная клетка. Треугольниками показаны реснички эпителия. Стрелочными наконечниками - вышедшие из клетки вирусы. Стрелками - внутриклеточные "мешки" с новообразованными вирусами, которые еще не вышли из клетки.

Таким образом они подтвердили что выделили коронавирус. Сравнив его полную последовательность с уже известными вирусами, они показали, что этот вирус действительно принадлежит к семейству бетакоронавирусов и близкородственнен SARS. Полученные последовательности были выложены в публичные базы данных и таким образом стали доступны ученым в любой точке планеты.

portret

Вести с полей

Ну что, с такими новостями прямо таки потянуло "выйти из запоя". В здравоохранении я не спец, но вот по вирусологии отличные на этой почве статьи выходят и главное очень быстро. Вот о них может и буду писать.

А пока об общей обстановке. Мы оказались почти в эпицентре одной из штатовских вспышек, до прославившегося Нью Рошеля тут 20 минут езды. Сами пока живы-здоровы, старший ребенок (живет отдельно) похоже уже переболел именно этим самым вирусом, по крайней мере симптомы сходятся. Ни его, ни нас никто не тестировал - тестируют только тех, кто прилетел на самолете или имел контакт с подтвержденной инфекцией. Вчера Трамп пообещал, что теперь тестировать будут всех, но как всегда наврал.

Школы закрывают только там, где есть серьезные случаи подозревать инфекции, остальные все открыты, что на фоне отсутствия тестирования видится идиотизмом. Но по крайней мере отменили разные кружки, дополнительные занятия и прочая. Родители уже приготовились сидеть с детьми, но поскольку все ожидают как минимум две недели без школы (ха, если бы!), то никто не торопится к этим двум неделям самостоятельно добавлять лишние дни.

Соседи относятся ко всему происходящему с тревогой, но и с несколько фаталистическим юмором. Все уверены, что вирус не остановить, ждут что вот-вот нагрянет. Руки перестали пожимать при встрече, но собираются в тесные кружки поболтать. Много кому сказали работать из дома, особенно тем, кто ездит на общественном транспорте. Но не всем. Я работаю из дома, а вот в компании жены что-то тянут и говорят что люди "должны решать сами".

В магазинах оживленно, мы стараемся туда не ездить без нужды, но когда я там был в последний раз, то пустых полок не заметил (разве что туалетной бумаги нет и бумажных салфеток).
portret

Новости журнала

Учитывая что почти год прошел с последней записи, несколько глупо объявлять что журнал закрыт. Кому было сильно интересно - сами уже догадались. Кому не интересно - тем не интересно.
ЖЖ довольно регулярно почитываю и даже иногда комментирую. На вопросы к старым записям продолжаю отвечать. Но писать пока нет ни времени, ни сил, ни желания.
Если есть интересные темы или просто вопросы - пишите в комментах, будем считать что это такой специальный "открытый пост" (хотя они у меня все открытые - пишите в любой не любую тему).
portret

Первая генная терапия идет в клиники

FDA сегодня одобрило использование технологии CAR-T (я о ней писал) для лечения acute lymphoblastic leukemia (ALL). ALL должна происходить из B-клеток, она должна быть устойчива к существующим препаратам, пациентам должно быть меньше чем 25 лет, и госпитали должны иметь специально-обученный персонал, умеющий контролировать цитокиновый шторм. Новартис также обязаны провести долгосрочное исследование безопасности этой процедуры для пациентов. Стоимость одноразовой процедуры - почти пол-миллиона долларов.

Это первая такая терапия, но (насколько я понимаю) патенты на принцип CAR-T уже истекли и поэтому конкурентов достаточно и работают они над самыми разными видами рака.

Сейчас наверно хороший момент оглянуться назад и посмотреть сколько времени уходит на разработку такой терапии. Собственно идея химерных рецепторов была протестирована аж в 1991 году, т.е. уже 26 лет назад! Однако ранние версии работали очень плохо и прошло 8 лет прежде чем были созданы более активные версии. Примерно тогда же (в 1998 году) были разработаны более эффективные методы доставки генов (кстати, основанные на ВИЧ). Первый эффективный результат в пациенте был опубликован в 2011 году. После этого в игру включился Новартис и довольно быстро (к 2013 году) провел два испытания на примерно 50 пациентах. И вот наконец сейчас эту технологию наконец начинают использовать доктора.
portret

Фотобакет

Пришлось вручную перенести картинки и переделать ссылки. Не во всех постах, конечно. Прошелся по тем, что отобраны для верхнего поста.

А про фотобакет такой вопрос - что для них будет хуже, если я у них аккаунт закрою или если он останется, хоть я им даже и не буду пользоваться? Мне все равно, но хочется им хотя-бы чуток напакостить. Может наоборот - не закрывать, а залить туда гигов 20 картинок и оставить их там лежать мертвым грузом?
portret

ВИЧ в Восточной Европе и Центральной Азии

UNAIDS к конференции в Париже выпустила очередной доклад по ситуации с ВИЧ в мире.

Количество новых инфекций в целом снижается, за исключением Восточной Европы и Центральной Азии.


(Обратите внимание на то, что вертикальные шкалы на правом и левом графике отличаются.)

Рост новых инфекций в этом регионе связан в первую очередь с Россией (81% всех новых инфекций) и Украиной (9% всех новых инфекций). В России в 2016 году было зарегистрировано 103 тысячи новых инфекций.

Со смертностью от СПИДа похожая ситуация:



В 2016 году в России было зарегистрировано 30 тысяч смертей от СПИДа (от примерно 40 тысяч во всем регионе).
portret

Коровы спасут человечество от ВИЧ!

Вы возможно вчера видели новости про коров и ВИЧ? Почему-то вдруг целый ряд новостных изданий подхватили именно эту статью, видимо трудно удержаться от таких заголовков.

Так при чем же тут коровы? Объяснение придется начать издалека.

Разнообразие ВИЧ в мире - одна из самых больших проблем для разработки профилактической вакцины. Сделать вакцину которая предотвращает инфекцию определенным видом вируса - непросто, но в животных это было сделано. К сожалению, такая вакцина не будет предотвращать инфекцию другими вариантами ВИЧ, потому что они отличаются от вируса в вакцине, так что иммунная система уже не распознает их.

Однако известно, что небольшой процент людей после многих лет инфекции вырабатывают так называемые "нейтрализующие антитела широкого спектра действия". Эти антитела (в клеточной культуре) очень эффективно нейтрализуют самые разные варианты ВИЧ. Некоторые из таких антител нейтрализуют >90% всех известных вариантов ВИЧ. Предположительно, если бы мы смогли создать вакцину, которая вырабатывает такие антитела, то она бы предотвращала инфекцию самыми разными вариантами ВИЧ.

Для того, чтобы научиться вырабатывать такие антитела, нужно иметь представление о том, как именно им удается нейтрализовать такое разнообразие вирусов. За последние 5 лет произошел огромный прогресс в этой области и сейчас уже известны более-менее "стандартные" способы действия таких антител. Довольно много нейтрализующих антител широкого спектра действия используют следующий способ:



Вирусный белок тут снизу, он покрыт гликанами - олигосахарами, которые защищают уязвимые части белка - те, которые выполняют важные функции в вирусе и поэтому не могут меняться так свободно, как другие его части. Антитело PGT145 широкого спектра действия показано серыми и фиолетовыми структурами сверху. У каждого антитела есть участок HCDR3, играющий важную часть в распознавании мишени, и у PGT145 этот участок очень длинный, что позволяет ему проникнуть между гликанами на поверхности белка и с помощью отрицательно-заряженного участка связаться с положительно-заряженным участком на поверхности вирусного белка оболочки.

Для того, чтобы выработать такие антитела с помощью вакцины, разные группы ученых в мире создают белки, которые аккуратно воспроизводят структуру вирусного белка оболочки, в том числе и гликаны на его поверхности. Они исходят из предположения, что если дать иммунной системе белок в правильной конформации, то иммунная система будет способна выработать подобные антитела. Однако тестирование этих реагентов на мышах, кроликах, и обезьянах пока не увенчалось успехом - они вырабатывают нейтрализующие антитела, но не широкого спектра действия (на людях еще не тестировали). Предположительно, проблема заключается в том, что антитела с длинным участком HCDR3 очень редки, и поэтому очень малы шансы на то, что они будут активированы данной вакциной. Но возможно также и то, что белок в этой вакцине на самом деле нестабилен или имеет еще какой-нибудь дефект.

И вот тут мы наконец добираемся до коров.

По не совсем понятным причинам, у коров очень большой процент антител имеет длинный участок HCDR3. Это не означает что их иммунная система лучше, чем у людей или мышей, это просто такое необычное ее свойство, но этот факт можно использовать для того, чтобы ответить на вопрос выше - заключается ли проблема в белке в вакцине или в недостаточном количестве антител с длинным участком HCDR3?

Коров вакцинировали этим белком и те довольно быстро выработали нейтрализующие антитела широкого спектра действия. Через 40 дней они были способны нейтрализовать 20% всех известных вариантов ВИЧ, а через год - больше 80%. Это подтверждает, что с белком все в порядке и что проблема у мышей, обезьян (и скорее всего - людей) в том, что антитела с HCDR3 очень редки.

Что это означает для разработки ВИЧ вакцин? Этот результат был вполне ожидаемым и большинство групп уже какое-то время работают над разработкой вакцин, в которых сначала будет использоваться белок, который будет эффективно активировать B клетки имеющие антитела с длинным HCDR3 участком, даже если те не связываются эффективно с ВИЧ. После такой стимуляции антител с длинным HCDR3 можно будет использовать белок из данного исследования, чтобы из этого нового разнообразия антител выбрать те, которые специфично распознают именно ВИЧ.