Category: животные

Category was added automatically. Read all entries about "животные".

portret

Верхний пост

Правила журнала
Как легко убедиться посмотрев мои старые записи, я обычно с удовольствием спорю с разными странными личностями приходящими ко мне в журнал. Однако на время эпидемии коронавируса в журнале вводится особый режим: Я хочу чтобы комментарии в журнале были представляющими интерес для читателей, а не просто местом для срача. Поэтому в редких случаях делаю предупредительный выстрел, но вообще за идиотские комментарии, хамство, и флуд отправляю в бан мгновенно.

Содержательные комментарии не по прямой теме поста вполне приветствуются.

Обо мне
Сейчас я довольно много пишу о коронавирусе, но я в нем не специалист. Читайте на свой страх и риск. По своей работе я вот уже больше 20 лет работаю с ВИЧ. Сначала занимался молекулярными аспектами его репликации, потом эволюцией и популяционной генетикой, последние лет 10-12 - вакцинами. Свою личность я не скрываю, можете все обо мне узнать погуглив Yegor Voronin (таких в Штатах немного, в основном выпадаю я).

Под катом в этом посте - небольшая выборка из написанного за последние 18 лет (с перерывом года на полтора), чтобы вам проще было сориентироваться.

Collapse )
portret

Биливердин и SARS-2

SARS-CoV-2 recruits a haem metabolite to evade antibody immunity

Попросили рассказать про эту статью, и хотя в итоге там оказалось совсем не то, про что спрашивали, статья однако все равно интересна, к тому же работали над ней люди, которых я неплохо знаю по их работам с ВИЧ.

Авторы являются структурными биологами, т.е. изучают как белки сворачиваются в определенные структуры и как потом форма этих структур определяет функцию белков. Для изучения структуры белка S коронавируса они наработали в клеточных культурах разные варианты этого белка. При этом они заметили, что если обычно растворы белков прозрачны, то эти белки имеют заметный зеленый оттенок, указывающий на присутствие какого-то пигмента. Поскольку они крутые биохимики, то им не составило большого труда выделить этот пигмент и определить что это биливердин.

Что такое биливердин? Наши эритроциты содержат белок гемоглобин, однако кислород связывается не с самим белком, а со специальным соединением - гемом, а белок лишь регулирует этот процесс, так что в легких кислород связывается с гемом очень хорошо, а в тканях - хуже, и таким образом высвобождается там где он нужен. Именно гем придает нашей крови красный цвет. Организм постоянно производит новые молекулы гема, потому что гем постепенно разрушается, сначала превращаясь в биливердин, а потом в билирубин, который и выводится по желчным каналам в кишечник и придает фекалиям характерный желто-коричневый цвет. Биливердин же зеленого цвета и именно благодаря ему наши синяки имеют сине-зеленый оттенок.

Самое загадочное в этой статье, и авторы это никак не объясняют, это откуда у них в клеточных культурах (в которых они производили белки) вдруг взялся биливердин? Я подозреваю, что они увидели этот зеленоватый цвет не просто в произведенных белках, а в белках которые в каких-то экспериментах для каких-то целей смешивались с кровью либо животных либо людей. Но это осталось за кадром.

Так или иначе, но авторы показывают, что белок S действительно очень хорошо связывается с биливердином, так что при нормальных концентрациях биливердина в крови (а его всегда там сколько-то есть), практически все копии белка несут на себе в совершенно определенном месте этот биливердин. Вот он зелененький на этой картинке:



Связывается биливердин в довольно интересном месте. На поверхности белка есть такая гибкая петля, которая постоянно болтается туда-сюда, подобно незапертой калитке. И в положении "туда" она открывает нейтрализующим антителам доступ к довольно уязвимой части белка. Биливердин вклинивается недалеко от калитки и запирает ее в положении "сюда" не давая ей полностью открыться. Таким образом нейтрализующие антитела, которые атакуют вирус в этом месте (и их похоже довольно много) оказываются неэффективными.

Авторы считают что это такой механизм избегания иммунного ответа. Я не совсем согласен, мне кажется что это никакой не механизм, а просто белок такой вот и есть в норме, с биливердином в этом месте, и "калитка" эта в норме и не должна открываться потому что там всегда ее придерживает биливердин. А если бы его не было, то вирус бы нашел другой способ держать калитку на запоре. Что собственно они сами и показывают - белки S из обычных сезонных коронавирусов биливердин не связывают (а вот SARS-1 - да).

Но вот на что эта работа действительно указывает, так это на то, что если измерять нейтрализацию вируса плазмой (и многими моноклональными антителами) в культуре клеток, то можно получить результаты, которые не соответствуют тому, что реально происходит в организме. Антитело может нейтрализовать вирус в культуре, но не нейтрализовать в организме. Или же надо всегда добавлять биливердин к вирусу в тестах проводимых на культурах клеток.
portret

Репликация коронавирусов

Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2
Как всегда у Nature Reviews - отличный обзор по базовым фактам о жизненном цикле "усредненного" коронавируса.

Утащу оттуда первую картинку и переведу основные моменты.



Желтым цветом на картинке помечены шаги репликации вируса, а красным - возможности эту репликацию как-нибудь остановить. Я буду приводить исходные названия на английском, чтобы было понятно о какой части картинки идет речь.

Жизненный цикл коронавируса во многом похож на жизненный цикл многих других РНК вирусов имеющих липидную оболочку.

Receptor binding. Начинается все со свободно плавающей вирусной частицы, которая содержит в себе 4 основных вирусных белка - шип оболочки S, белок оболочки E, матрикс M, и нуклеокапсид NC, внутри которого находится вирусный геном в виде одноцепочечной РНК. Эта частица с помощью шипа оболочки S должна связаться с рецептором ACE2 на поверхности клетки-мишени. На этой стадии вирус можно нейтрализовать заблокировав это связывание, что обычно делают нейтрализующие антитела, но можно разработать и другие подходы.

Entry. Помимо связывания с белком ACE2, шип S также должен быть разрезан в определенном месте какой-нибудь хозяйской протеазой, например TMPRSS2. Связывание шипа S с ACE2 и это разрезание ведут к изменениям в белке S, который меняет форму и физически сближает вирусную липидную оболочку и оболочку клетки, что ведет к их слиянию. Это слияние может происходить как на поверхности клетки, так и внутри эндосом - специальных "пузырьков" которыми клетка захватывает наружное содержимое или просто рециркулирует клеточную мембрану и поверхностные белки. Так или иначе, содержимое вирусной частицы оказывается внутри клетки. На этой стадии можно заблокировать вирус блокируя клеточные протеазы, но это довольно сложно, потому что у них есть важные функции и вообще их в организме очень много.

Fusion and uncoating. Самое главное содержимое вирусной частицы - вирусный РНК геном. Внутри вирусной частицы он заключен внутрь капсулы (капсида), состоящей из белка NC. Когда этот капсид оказывается в цитоплазме клетки-мишени, то он распадается высвобождая вирусную РНК, которая для клетки-мишени выглядит как любая другая РНК произведенная ею самой в ядре.

Primary translation and polyprotein processing. Клеточная мРНК используется как матрица для синтеза клеточных белков (трансляции). Хозяйские системы берут вирусную РНК и начинают производить по ней (вирусные) белки. Эти 16 белков производятся не каждый отдельно, а как два больших "поли-белка". Внутри одного из этих поли-белков имеется вирусная протеаза, она активируется и нарезает эти поли-белки на их составляющие. Если эту протеазу ингибировать, то это должно остановить репликацию вируса.

Viral RNA synthesis and Translation. Заметьте, что на этой стадии вирус состоит в одной-единственной молекуле РНК. Для дальнейшего размножения вирусу надо наработать множество копий своего генома. Получившиеся в результате трансляции и нарезания вирусные белки "отбирают" исходную копию РНК у хозяйских механизмов трансляции и начинают копировать ее. С +РНК цепи делаются копии -РНК, которые служат матрицей для создания новых +РНК, с которых опять делаются копии -РНК и т.д. Этот процесс идет в эндоплазматическом ретикулуме - специальном клеточном органе, находящемся около ядра и состоящем из массы липидных слоев. Обычно он служит клетке для синтеза белка, но вирусные белки приспосабливают его для того, чтобы наделать сложные двойные пузыри и прочие структуры в которых идет синтез вирусного генома.

Процесс репликации вирусного генома - один из основных шагов для блокирования вирусной репликации, потому что обычно клетка не делает копии РНК с другой РНК, и для этого у вируса существует белок, которого обычно нет в клетке - РНК-зависимая-РНК-полимераза. Этот шаг атакует например гилеадовский ремдесевир.

Accessory proteins-host interactions. Помимо основного генома, вирус также создает укороченные геномы, которые служат для синтеза целого ряда вирусных белков. В ходе этого процесса создаются новые РНК, кодирующие новые белки, которые на начальной стадии вирус производить не может. Эти белки могут иметь самые разные вспомогательные функции, например блокировку сигналов опасности, которые обычно запускает зараженная клетка.

Assembly. Но основная цель вируса на этой стадии - наработать как можно больше белков для создания новых вирусных частиц, все тех же S,E,M,NC. Они собираются вместе, распознают вирусную РНК, и создают новую вирусную частицу. На этой стадии обычно происходит ряд разных процессов которые в принципе можно постараться заблокировать.

Exocytosis. Вирусная частица собирается около клеточной мембраны. В клетках существуют механизмы позволяющие "выпятить" и "отщипнуть" часть клетки внутрь специальных секреторных пузырьков внутри клетки, в результате чего получаются "пузырьки внутри пузырьков", вот их вирус и использует для своих целей. Новые вирусы оказываются внутри секреторных пузырьков унося с собой часть клеточной мембраны, которая на этой стадии становится вирусной мембраной.

Virus release. Секреторные пузырьки опустошаются наружу, выпуская новое поколение вирусных частиц, которые могут заражать новые клетки.
portret

Как коронавирус борется с иммунной системой

Где-то в комментах дали ссылку на вот эту довольно интересную статью:
Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2

По меркам РНК вирусов, геномы коронавирусов довольно большие - 30К нуклеотидов, что позволяет им кодировать довольно большое количество белков. Один из этих белков NSP1 значительно варьирует по последовательности и по размерам, но имеет одинаковое свойство, а именно - блокирует в зараженных клетках трансляцию.

Вкратце напомню: наши гены закодированы в ДНК, которая находится в ядре, с ДНК снимаются копии РНК, РНК идет в цитоплазм, где рибосомы транслируют РНК и по ним синтезируют белки, которые собственно и отвечают за практически все строение и функции клеток.

Зачем коронавирусам блокировать трансляцию, ведь клетка от такого блока довольно быстро умрет? Точно не известно, но одна из теорий заключается в следующем. В клетках существуют сенсорные механизмы, которые по разным признакам детектируют появление в ней вируса, и в ответ запускают производство интерферона. Интерферон это сигнальная молекула и он действует как на саму зараженную клетку, так и на все другие клетки поблизости и запускает огромное количество самых разных антивирусных механизмов. Однако большинство этих механизмов не активируются моментально а требуют экспрессии генов, кодирующих соответствующие белки. Я точно не помню, но что-то вроде 10 процентов всех наших генов это гены, которые активируются в ответ на интерферон и производят белки отвечающие за антивирусные системы. Отсюда ответ очевиден - нет трансляции, нет и антивирусных белков, и коронавирус может делать в клетке что хочет.

ОК, теперь собственно к статье. На самом деле самое интересное я уже рассказал, в статье уже собственно детали, в которые я вдаваться не буду, покажу лишь самую интересную картинку из нее.

Авторы добавляют Nsp1 к части рибосомы с которой он связывается (это показано в предыдущих экспериментах, которые я пропустил) и используют криоэлектронную микрофотографию чтобы определить структуру получающегося комплекса. Это довольно крутой метод, разработанный в последние лет 10, который позволяет собирая информацию с тысяч фотографий (с довольно низким разрешением) получать детали молекулярной структуры с разрешением до атома. И вот что они видят:



Про Nsp1 известно, что он состоит из большой глобулярной части от которой тянется гибкий "хвостик" с небольшой "кисточкой" на хвосте, состоящей из двух спиралей. И вот на этой структуре видно что у канал рибосомы, в который обычно заходит РНК, физически "заткнут" этой "кисточкой" белка Nsp1, что не дает туда войти РНК и таким образом блокирует трансляцию. Остальную часть Nsp1 разглядеть не удается, видимо потому что гибкий "хвост" дает возможность основной части белка болтаться как попало (т.е. она не находится в какой-то конкретной позиции, которую можно было бы определить) но вот эта кисточка там сидит очень уверенно и авторы потом даже определяют какие конкретные ее аминокислоты взаимодействуют с аминокислотами в канале.

Некоторые (особо умные) читатели уже наверно сообразили что у этого вирусного механизма борьбы с иммунным ответом есть одна большая проблема - вирусу для репликации и производства новых вирусных частиц тоже нужны белки, а значит и трансляция. Но у вируса похоже все "продумано" - каким то образом его собственная РНК обходит этот блок, видимо что-то вынимает хвост Nsp1 из рибосомы, и позволяет синтез вирусных белков. Но вот каким - никто пока не знает.
portret

Гликозилирование белка S

Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike

Я уже писал про белок оболочки Sпродолжение). Это белок, которым вирус собственно "цепляется" за белок ACE2 на поверхности клеток которые он заражает. В процессе формирования новых вирусных частиц в зараженной клетке вирус выходит захватывая с собой кусок клеточной мембраны. Вот иллюстрация этого процесса для ВИЧ, но коронавирус это делает очень похожим образом:


На картинке снизу - клеточное пространство, сверху - "противная наружа", а разделяет их липидная мембрана в которой полно обычных клеточных белков (они тут очень схематично изображены несколькими зеленоватыми червячками), а также вирусных белков оболочки (желтые грибки). Таким образом, внешняя часть вирусной частицы выглядит почти неотличимо от поверхности обычных клеток. Отличает ее лишь присутствие вирусных белков, в том числе и интересного нам белка S на поверхности коронавируса.

Вирусу, естественно, невыгодно отличаться от клеточных мембран, поэтому он эволюционирует так, чтобы сделать свой белок S менее заметным для антител. Один из способов это делать - это иметь на белке сайты гликозилирования. Большая часть белков на поверхности клеток несет на себе так называемые гликаны. Это такие поли-сахара, которые одним сахаром присоединяются к белку, а потом разветвляются как кусты или деревья.

Вот пример:


Тут показаны два гликана, у обоих справа схематично изображено место присоединения гликана к белку - аминокислота аспарагин, а влево уходят сами гликаны. Каждый кружочек или квадратик это разный сахар, причем тут показаны всего два вида гликанов, но вообще они бывают очень и очень разные с разными сахарами и разными структурами.

Что важно, несмотря на то, что гликаны бывают очень разные, все они начинают свою жизнь как гликан показанный на картинке справа - он почти целиком состоит из маннозы и поэтому называется олигоманнозным. Специальные ферменты в клетке постепенно обрезают эту маннозу, а другие довешивают разные сахара и когда белок готов к переносу на поверхность клетки, его гликаны выглядят так как на картинке слева. Их называют сложными.

К чему я все это рассказываю. Вирусы тоже обвешивают свои белки оболочки подобными гликанами, так что для антител они во-первых, выглядят "своими", а во-вторых, даже если иммунная система их распознает как чужеродные, то на них очень трудно вырабатывать антитела. Таким образом вирусы защищаются гликанами от иммунного ответа.

Собственно из статьи я хочу привести всего одну картинку:


Это сравнение количества и типа гликанов на белках оболочки от разных вирусов, названия которых написаны внизу. Верхний ряд - это вид на эти белки сверху, как если бы вы взяли вирусную частицу и повернули ее белком оболочки прямо к себе. Видно, что все эти белки оболочки являются тримерами - они состоят из трех идентичных частей соединенных вокруг общей оси симметрии. Нижний ряд - это те же самые белки что и сверху, но теперь мы смотрим на них сбоку и снизу у них "ножка" которой они прикрепляются к вирусной частице. Серые формы - это собственно белки. А фигурки показанные градиентом от белого к зеленому - это собственно гликаны о которых я выше и рассказывал. Чем более зеленый гликан - тем ближе он к начальной форме, к олигоманнозе, а чем белее - тем он более сложный.

Сравним белок S (второй на картинке) с белком Env от ВИЧ (пятый). Видим, что у ВИЧ белок оболочки очень густо покрыт гликанами, к самому белку практически невозможно подобраться за исключением небольших карманов которые вирус использует для связывания с рецептором на поверхности CD4 клетки. Поэтому против ВИЧ очень трудно сделать вакцину - нужны очень необычные антитела которые либо могут проникнуть сквозь этот защитный слой гликанов, либо связаться с ними. Такие антитела у людей образуются, но на их образование обычно уходят годы инфекции.

А вот белок S у коронавируса достаточно открыт. Это довольно хорошие новости, потому что это означает что к нему должно быть довольно легко выработать антитела и у него должно быть много уязвимых мест. Естественно, нет гарантий что в ходе разработки вакцины у коронавируса не обнаружится каких-либо своих способов уходить от иммунного ответа, но это маловероятно. Жизненная стратегия таких вирусов - успеть размножиться и перескочить к следующему хозяину до того как организм успеет среагировать.
portret

Совпадение? Не думаю...

SARS нерукотворный? Генеалогия уханьского коронавируса

Наконец дошли руки до этого цикла в шести томах. Не скажу что дотошно прочитал все от начала до конца, но зато самые важные части прочитал внимательно несколько раз.

Объем работы проделан огромный и написано захватывающе. Вот серьезно, человеку бы околонаучные триллеры с элементами фантастики писать - я бы читал с огромным удовольствием. Лучше всякого Дэна Брауна или Майкла Крайтона - куча интриги и куда аккуратней с научной точки зрения.

О чем вообще идет речь в этом тексте? Вообще говоря, там практически нет новых фактов, текст лишь умело собирает в кучу массу уже известной информации. Я бы разделил аргументы в нем на два типа: Один это - смотрите, эти ученые постоянно ищут новые вирусы в животных и потом эти вирусы модифицируют, все это неспроста, они вполне могли создать вирус. Я согласен что могли, может для кого-то это и сюрприз, но вообще это никакая не тайна, а исследования которые на мой взгляд как раз очень важны. Поэтому я этот тип аргументов тут даже рассматривать не буду, можете считать это серьезным ограничением моего анализа, дело ваше.

Второй тип аргументов мне кажется гораздо более интересным: Глядя просто на имеющиеся у нас последовательности разных вирусов автор пытается оценить вероятность того, что вирус SARS-2 искуственный или естественный.

Чтобы не было путаницы в терминах, давайте сразу определим несколько возможных сценариев искусственности или естественности происхождения вируса:

  1. Вирус разработали специально как биологическое оружие, поэтому разработчики аккуратно спрятали все следы искусственных модификаций, и потом специально или нечаянно выпустили наружу. Теория эта по определению недоказуемая и неопровергаемая на основании последовательностей. Ее даже не рассматриваем.

  2. Ученые работали с какими-то известными нам вирусами, искуственно их модифицировали, и один из таких модифицированных вирусов умудрился сбежать из лаборатории.

  3. Ученые работали с неизвестными нам вирусами, искуственно их модифицировали, и один из таких модифицированных вирусов умудрился сбежать из лаборатории.

  4. Вирус совершенно естественный и либо убежал из лаборатории, либо сам по себе попал к людям. Поскольку последовательность вируса в этих ситуациях будет идентичная, то рассматриваем их как единую теорию о естественном вирусе.



Известные вирусы
Начнем со втрой теории о том, что вирус создан путем манипуляций с известными нам вирусами. Эту теорию довольно просто отбросить, потому что при сравнении SARS-2 с опубликованными последовательностями видно, что по сравнению даже с самым близкородственным вирусом летучих мышей RaTG13, у него больше тысячи мутаций. Автор предполагает что возможно вирус RaTG13 долго размножали в клеточных культурах (в пробирке) и эти мутации появились таким образом. В этом я кое-что понимаю, сам занимался эволюцией вирусов в культуре и могу сказать, что это довольно дикое предположение. Для того чтобы в вирусе появилось такое количество мутаций, нужно его культивировать годами. Для примера, вот тут в течение года культивировали ВИЧ, один из самых быстро-эволюционирующих вирусов. Сколько там накопилось мутаций? 30! Даже если скорректировать на длину генома (коронавирус в 3 раза длинней), то получится около 100 в год. Т.е. даже если бы SARS-2 мутировал со скоростью ВИЧ, то пришлось бы культивировать его 10 лет чтобы получить такую разницу в геномах. При этом надо понимать, что когда вирус культивируют в пробирке, то он будет приспосабливаться именно к жизни в пробирке и терять свою приспособленность к гораздо боле сложной жизни внутри организма хозяина. Поэтому после многих лет жизни в пробирке на выходе бы скорее всего получился вирус, который в людях размножаться бы не смог. В общем, теорию 2 можно уверенно отбросить.

Неизвестные вирусы
Рассмотрим теорию 3. Поскольку предполагаемые вирусы из которых мог быть собран SARS-2 нам согласно этой теории неизвестны, то места для разных гипотез в любую сторону становится намного больше. Однако если мы предполагаем что ученые специально не пытались спрятать свои манипуляции, то теоретически следы их модификаций могли остаться. Чем более необычные части мы найдем, тем уверенней мы можем сказать, что они искусственного происхождения. Например если мы вдруг обнаружим белок оболочки ВИЧ вместо коронавирусного белка S, то это очень сильный аргумент в пользу искусственности происхождения.

Никаких таких очевидных манипуляций автор после множественных усилий и самых разных анализов не находит. Процитирую окончательный вывод этой статьи.

На всякий случаю, поясню: это НЕ означает, что CoV2 точно был синтезирован в лаборатории. Да, чисто технически, создать такой штамм современному вирусологу не составило бы труда. Но прямых доказательств тому, что кто-либо это сделал, нет. А странные совпадения пока не могут служить даже косвенными доказательствами.

Т.е. beyond reasonable doubt доказательств нет. Но мы тут не в суде присяжных, а просто в интернетах болтаем. Давайте посмотрим какие же странные элементы автор таки нашел в последовательности SARS-2. Я вижу два.

Рекомбинация в районе RBM
В разделе "Панголины" автор пишет про очень необычную организацию белка S в SARS-2. Ближайшим известным родственником SARS-2 является летучемышиный вирус RaTG13. Белок S у SARS-2 тоже очень похож на белок S из RaTG13 (но не идентичен ему), но вот в одном месте, ключевом для функции этого белка, он вдруг становится похож не на летучемышиный вирус, а на вирус из панголинов.

Действительно, вот картинка, всего одна аминокислота отличается у SARS-2 и у панголина:



Автор пишет: ...очень странная должна была произойти рекомбинация — как будто кто-то просто взял кусок RBM из панголиньего штамма и заменил им RBM в RaTG13. А это уже смахивает не на эволюцию, а на, прости Дарвин, Intelligent Design.

Однако для того чтобы более аккуратно оценить родство между панголиновым вирусом и SARS-2, смотреть надо не на аминокислоты, а на кодирующую их нуклеотидную последовательность. Я вот сделал такой анализ:



И тут картина совсем иная! Вместо "всего одной аминокислоты" мы имеем 26 мутаций на небольшом куске из 216 нуклеотидов, т.е. 12% отличий или всего 88% сходство. Поэтому теория об искуственном происхождении вируса SARS-2 должна звучать так: "кто-то взял неизвестный нам вирус летучих мышей и вставил в него кусок из неизвестного нам вируса панголинов". Конечно, такое может быть, но звучит уже куда менее убедительно. Тем более что (насколько я знаю) известный панголиновый вирус всего один (Upd: Или нет, кажется два).

Автор также рассуждает о том, что образование такого вируса естественным образом очень маловероятно. Он пишет: Другой вопрос, где именно летучемышиные и панголиньи вирусы могут друг с другом встречаться для таких оргий — в горных пещерах, “мокрых рынках”, приютах для конфискованных животных, или даже в лабораториях.

Отмечу тут в сторону, что вообще вот этот стиль автора - "я подмигну, а вы сами догадывайтесь" мне в целом не нравится. Ну, то есть, если бы это была художественная литература аля уже упомянутый Дэн Браун, то это было бы нормально, но вот в таком серьезном анализе, лично меня раздражает.

Как автор совершенно верно говорит - коронавирусы рекомбинируют постоянно, но я не уверен, что он понимает масштаб происходящего. Я уже приводил вот эту статью ранее, в ней авторы посмотрели на 45 коронавирусов и нашли в них 105 рекомбинаций, причем в основном имеено в белке S:



И надо также понимать, насколько ограниченны наши знания о распространенности коронавирусов, о заражаемых ими животных, и о том, как быстро они эволюционируют и как часто рекомбинируют. Судя по тому, что все панголины (из которых выделили вирус) умерли от выделенного из них вируса, я бы предположил, что скорее всего это вообще не вирус панголинов, а подцепили они его где-то еще уже после поимки. Кто знает от кого они его подцепили, но для естественного появления SARS-2 вовсе не обязательно предполагать оргии между летучими мышами из Юннаня и панголинами из Гуандуня.

Появление фуринового сайта

Автор обращает внимание на тот факт, что у SARS-2 по сравнению с ближайшим родственником RaTG13 есть вставка четырех аминокислот, которые образуют последовательность распознаваемую протеазой фурин. Интересная разница, особенно учитывая что вообще у семейства бетакоронавирусов в этом месте фуринового сайта нет, а есть он лишь у относительно удаленных коронавирусов.

Я бы сказал, что это достаточно необычный фрагмент чтобы о нем можно было предположить что он искусственный, ну по крайней мере пока не обнаружатся естественные бетакоронавирусы с подобными сайтами. Прямых следов того, что его вставили искусственно нет, но с современными методами модификации геномов я бы никаких таких следов и не ожидал.

Окончательный вывод
Итак, какова наиболее вероятная теория искусственного происхождения SARS-2? Кто-то нашел новый вирус летучих мышей, а также совершенно новый вирус панголинов и никому об этом не сказал. Последний факт мне кажется довольно невероятным, потому что новости о новом панголиновом вирусе были бы легкой и интересной публикацией. Этот кто-то по каким-то причинам сделал химерный вирус из этих двух вирусов, а также вставил в него новый фуриновый сайт. Это вполне вероятно, потому что в области коронавирусов специфичность белка S это одна из наиболее активных тем исследований и вполне можно предположить что кому-нибудь могло бы показаться интересным сделать такую химеру (среди множества других). И потом этот вирус сбежал из лаборатории с самым высшим уровнем безопасности. Что тоже возможно, примеры тому есть, но надо заметить что примеров этих немного, учитывая количество таких лабораторий и все время их существования.

В общем, в сухом остатке - каждый может остаться при своем, потому что описываемые выше вероятности в процентах не посчтитать. Кому нравится теория искусственного происхождения - тот вполне может найти во всем этом подтверждение своим убеждениям. Кто считает, что вирус естественный - тоже имеет факты в пользу этой теории.
portret

Что там у котов

Пара вводных слов, прежде чем перейдем собственно к сегодняшним статьям.

Предисловие 1: В прошлом посте развернулись длинные дискуссии о разных хитрых способах стерилизовать маски, одежду, квартиры и т.п. Мой личный совет: Без особой необходимости не заморачиваться (если вы медсестра работающая с коронавирусными пациентами и вам дали одну маску на пять дней, то это особый случай). Чем сложнее система, тем больше шансов что она где-то даст осечку. Чем жарить в микроволновках, облучать ультрафиолетом, и т.п., лучше продумайте простые подходы, которые вы точно будете соблюдать. Как не забыть помыть руки и что делать с ключами или телефоном которые вы достали на улице, как понизить необходимость выходить из дома, как организовать приход с покупками так, чтобы можно было спокойно вещи протереть или помыть, и т.д.

Предисловие 2: Сейчас многие статьи выкладывают в препринтах. Прошлый пост был о препринте, и в сегодняшнем их два. Если вы не знаете что это такое: Присланную в журнал статью обычно дают прорецензировать двум-трем специалистам в соответствующей области. Такое рецензирование не гарантирует качество, но в среднем это лучше чем ничего. Зачастую после рецензий авторов заставляют либо что-то исправить, либо что-то доделать, либо вообще не берут в печать. Препринты - это начальные версии статей написанные авторами до того как их кто-либо рецензировал. Я не специалист по коронавирусам, я читаю и смотрю на эти данные в меру своего ограниченного понимания. Так что читайте на свой страх и риск.

ОК, сегодня у нас две статьи.

Susceptibility of ferrets, cats, dogs, and different domestic animals to SARS-coronavirus-2 (pdf)

Авторы заражали разных домашних животных SARS-CoV-2 и смотрели что получится. Народ серьезный, для таких экспериментов требуется супер-лаборатория уровня BSL4 (самый высший уровень безопасности).

Поскольку речь у нас пойдет о кошках, то сфокусируемся на экспериментах с ними.

Пяти "полувзрослым" (8 месяцев) кошкам в нос закапали серьезную дозу вируса. Двух кошек раскромсали на шестой день после этого, обнаружили вирусную РНК в верхней дыхательной системе обоих кошек, и в кишечнике одной из них. Что интересно - не в легких. В верхней дыхательной системе вирус был живой, в кишечнике - нет.

Трех оставшихся кошек рассадили по отдельным клеткам и рядом с каждой поставили по клетке с незараженной кошкой, чтобы понять, может ли передаваться вирус. Немного странно, но авторы говорят что образцы из носа у кошек они брать не могли, потому что кошки сопротивлялись, но им наверно видней. В результате они анализировали только стул. Через пять дней вирусную РНК они нашли в стуле у всех трех зараженных кошек. Из трех "тестовых" кошек заразилась всего одна, что они определили сначала по появлению вирусной РНК в стуле, а потом и во внутренних органах. Т.е. вирус может передаваться от кошки к кошке, но похоже что не очень эффективно.

Они повторили эти эксперименты также на двух "молодых" кошках (2-3 месяца). Эти эксперименты описаны гораздо хуже, не совсем понятно что именно было сделано, но интересно, что в отличие от полувзрослых кошек, молодые болели гораздо сильней и на аутопсиях были видны более серьезные повреждения дыхательных путей, а также вирус был найден в легких. Т.е. похоже что молодые кошки хуже переносят инфекцию.

Помимо кошек, авторы также нашли что вирус хорошо заражает хорьков, но плохо собак, куриц, свиней, и уток.

SARS-CoV-2 neutralizing serum antibodies in cats: a serological investigation (pdf)

В этой статье авторы протестировали кучу кошек в Ухане на антитела к SARS-CoV-2. Если забыли, то напоминаю, что антитела - это признак уже прошедшей инфекции.

Вырабатываемые иммунной системой антитела - довольно специфичны к каждой инфекции, но если вирусы близкородственные, то нужно показать, что ваш метод детектирует именно антитела к тому варианту, который нужен и не реагируют с другими. У кошек есть свои собственные коронавирусы и в первую очередь следовало показать, что их тест не детектирует инфекцию ими, а специфичен к SARC-CoV-2. Авторы cделали очень правильный контроль - 39 образцов, взятых у кошек в 2019 году. По ним они установили границу чувствительности своего метода, так чтобы все эти образцы были точно отрицательными. Таким образом они отсекли потенциальную реакцию их реагентов с антителами к каким-нибудь другими кошачьим коронавирусам. Они также протестировали реакцию с антителами от кошек про которых было известно, что они переболели одним из наиболее распространенных кошачьих коронавирусов и показали что реакции нет. Таким образом они неплохо подтвердили специфичность своего теста.

Среди 104 образцов собранных в этом году они получили 15 положительных. Три из них были от кошек, чьи хозяева переболели коронавирусом, шесть - из какого-то кошачьего госпиталя, и еще шесть просто от бездомных кошек. Они также подтвердили, что эти антитела не просто связываются с белками SARS-CoV-2, но и имеют способность нейтрализовать этот вирус в культуре клеток. И наконец, они напрямую показали, что эти антитела узнают конкретные вирусные белки SARS-CoV-2

Что интересно - больше всего антител было у тех кошек, чьи хозяева переболели коронавирусом. Т.е. возможно они получили более крупную дозу, чем кошки которые возможно были лишь временно в контакте с зараженными людьми или кошками.

Что со всей этой информацией делать?

В первую очередь нужно конечно больше исследований чтобы понять, насколько эффективными переносчиками вируса являются кошки и насколько хорошо они могут заражать людей. Эти две статьи в сумме дают довольно надежные свидетельства что кошки могут заражаться этим вирусом, он у них может вызывать болезнь, и они могут передавать его друг другу. Но все это следует подтвердить, в том числе и эпидемиологическими исследованиями.

Если вы не тусуетесь с соседями (и правильно делаете), то и кошек их лучше не гладить. Если вы заболели коронавирусом, то следите за своей домашней кошкой - возможно она заразится от вас.
portret

Белок S (продолжение)


Закончим разбор предыдущей статьи. Мы остановились на том, что авторы получили псеводтипированный вирус VSV который нес на себе белок S из нового коронавируса, который они называют SARS-2. Этот вирус уже можно использовать для изучения свойств SARS-2.

Для того, чтобы попасть внутрь клетки, вирусу как правило нужно связаться с каким-нибудь белком на ее поверхности. Про SARS было известно, что он связывается с белком ACE2. Поскольку S белок SARS-2 очень похож на S белок SARS, то логично было предположить, что и он тоже использует ACE2.

Для того, чтобы это проверить, авторы первым делом попробовали заразить полученным вирусом целый набор клеточных линий, полученных от людей и от разных животных, что и показано на панели С. В верхней части картинки - заражение диким вирусом VSV, у которого белок оболочки довольно необычен тем, что позволяет вирусу заражать огромное количество самых разных клеток. Интересно, что несмотря на очень широкое использование этого свойства, до сих пор точно не определено, с чем же именно он связывается на поврехности клеток. Так или иначе, верхняя панель - это просто контроль на то, что все эти клеточные линии в принципе могут быть заражены.

На средней панели заражение псевдотипированным VSV несущим белок S от SARS. Видно, что он хорошо заражает парочку человеческих клеточных линий, другие чуть похуже или вообще нет, отлично клетки обезьян и хорошо собачьи. Остальные почти не заражает.

На нижней панели результаты с белком S от SARS-2. Видно, что результаты почти идентичные средней панели, что намекает на то, что этот вирус связывается с тем же белком на поверхности клеток, что и SARS (т.е. ACE2).


Для подтверждения этого предположения, делаем "контрольный выстрел" - панель А на картинке справа. Берем клетки BHK-21, которые (как видно из эксперимента выше) SARS-2 не заражает. Добавляем у них на поверхности человеческий белок ACE2 - теперь заражает; ACE2 из летучих мышей - тоже заражает; человеческий APN (рецептор для вируса MERS) - не заражает (но MERS заражает); человеческий DPP4 (рецептор для еще одного коронавируса) - не заражает.

На этом, казалось бы, можно остановиться, но авторы делают еще пару экспериментов, которые подчеркивают чем действительно хорошая работа отличается от средненькой. На панели В они делают дополнительный контроль - берут обезьяньи клетки Vero (которые как мы видим выше заражаются SARS и SARS-2) и перед инфекцией они добавляют к ним антитела против ACE2. Эти антитела связываются с этим ACE2 и не дают связаться с ним белку S, таким образом блокируя инфекцию вируса. И действительно - эти антитела блокируют как SARS, так и SARS-2, но не MERS. Таким образом они показывают, что инфекция этих клеток проходит именно через белок ACE2, а не какой-либо еще белок на их поверхности.

И самый последний контроль на панели С. Чтобы подтвердить, что результаты предыдущих экспериментов - не артефакт наблюдаемый лишь с псевдотипированным VSV вирусом, авторы повторили таки эксперимент с диким SARS-2, выделенным из пациента и показали что добавление ACE2 к клеткам BHK-21 ведет к активному распространению SARS-2 в этих клетках.
portret

Белок S

Предыдущий выпуск закончился выкладыванием геномной последовательности нового коронавируса в публичные базы данных. А продолжаем мы с того, как эта последовательность может быть использована.

Статья: SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor



Разберем буквально половину первой картинки. Заранее прошу прощения у биологов, буду разбирать все буквально на пальцах, чтобы всем было более-менее понятно.

Эта статья фокусируется на белке S. Белок S - это наружный белок вируса, который собственно и является той "короной" которую мы видели в предыдущем выпуске на электронной фотографии. Этот белок используется вирусом чтобы прицепиться к клетке-мишени и затем слить мембранные оболочки вируса и клетки, таким образом доставляя содержимое вирусной частицы в клетку.

Выложенную последовательность нового коронавируса (авторы называют его SARS-2) можно сравнить с другими коронавирусами. Лучше всего с SARS, потому что (как было написано в прошлом выпуске) это самый близкородственный к нему человеческий вирус. Просто даже по этой информации уже можно сделать кое-какие (теоретические) выводы.

Смотрим на панель А. Во-первых, это довольно стандартный короновирусный белок S. У него есть две основные части - S1 отвечает за связывание с клеткой, S2 - за собственно проникновение внутрь. В S1 есть район который собственно и связывается с белком на поверхности клетки мишени. В S2, почти на С-конце есть район TD которым S крепится на мембране вируса. Во многих коронавирусах (но не в SARS) между S1 и S2 есть место которое режется протеазой, так что эти две части превращаются в два отдельных белка, которые тем не менее остаются соединенными вместе, не распадаются. Судя по последовательности авторы предположили, что скорее всего в SARS-2 именно так и происходит.

ОК, переходим от теории к практике. Как можно делать с этим белком эксперименты если у тебя нет ни белка, ни даже гена который можно было бы использовать чтобы этот белок произвести? Буквально лет 15 назад воспроизведение в своей лаборатории нужного гена с известной последовательностью было бы нетривиальной задачей. Пришлось бы начать с близкородственного гена (например SARS) и потом путем множественных шагов с клонированием и мутагенезом постепенно воспроизводить нужный. Сейчас же существует куча коммерческих компаний, которым можно просто послать по емейлу требуемую последовательность и через считанные дни получить нужный кусок ДНК по почте. Это не просто быстрее, но зачастую даже и дешевле, особенно если проект сложный. Это и сделали авторы. Они просто синтезировали кусок ДНК кодирующий белок S нового SARS-2.

При работе с белками очень удобно иметь антитела, которыми связываются с нужным белком и позволяют "увидеть" и отличить его от всех прочих белков. Для S белка нового коронавируса (который авторы этой статьи называют SARS-2), таких антител еще не было, поэтому авторы приделали к хвосту этого белка специальную метку (HA) для которой такие антитела существуют. Поскольку они все равно синтезировали ДНК, то им это сделать было довольно просто - заказывая ДНК они просто добавили в конце соответствующую последовательность.

На верхней части панели B мы видим примерно то, что предсказывалось по последовательности - белок вируса SARS не разрезан и имеет вес примерно 180kDa, а белок вируса SARS-2 есть и целиком и в порезанном виде (90kDa). Это просто белок полученный в клетках, а на вирусе эти белки иногда ведут себя несколько иначе. Как это проверить?

Есть такой супер-удобный для данных целей вирус VSV. Он хорош тем, что неприхотлив - когда он выходит из клетки то цепляет на себя любой белок который есть на поверхности клетки, и если этот белок может осуществлять связывание и слияние мембран, то ему этого достаточно. Собственный белок оболочки VSV при этом можно выкинуть, чтобы он не мешался в экспериментах. Дополнительным плюсом является то, что вирус этот совершенно безопасный, поэтому с ним можно работать без особых предосторожностей, которые были бы нужны для работы с диким вирусом SARS. Такая система называется псевдотипирование вирусов.

Авторы псевдотипировали VSV белками S от SARS и от SARS-2 и результаты мы видим на панели B внизу. У SARS белок так и остался целым, а у SARS-2 он практически весь порезан на S1 и S2 фрагменты. S2 мы видим на картинке, потому что именно к нему прикреплена метка HA которую распознают антитела, а S1 не виден. Там есть еще дополнительная тонкая полоска в районе 130kDa - что это такое я не знаю и авторы не упоминают, я думаю это скорее всего продукт какой-то деградации белка, возможно в нем есть еще какой-то сайт по которому его режет какая-то протеаза.

На этом пока все, к панели C вернемся в следующем выпуске.
portret

Порядок прилагательных

Никогда об этом не задумывался, но на реддите недавно увидел и это поглотило мой мозг :). В английском языке, если перед существительным стоят несколько прилагательных, то они должны быть расположены в определенном порядке: количество, оценочное мнение, размер, возраст, форма, цвет, происхождение, материал, предназначение. Например, big red dog, но не red big dog (размер идет перед цветом). Гуглите "order of adjectives" если нужны еще объяснения или примеры.

Интересно, что гугленье "порядок прилагательных перед существительным" ведет опять же к описанию этого правила в английском языке, хотя в русском прилагательные расставляются похожим образом. "Большая красная собака" звучит правильней чем "красная большая собака".

Еще интересно, что это правило работает и в обратную сторону, т.е. порядок прилагательных может указывать на правильную интерпретацию категорий. Например во фразе "маленький липовый листок", липовый идет после размера, а значит относится к категории "материал" или "происхождение", т.е. речь идет о листе дерева. А если их переставить местами: "липовый маленький листок", то липовый идет до размера, а значит относится к категории "оценочное мнение", т.е. речь идет о каком-то поддельном листе.